白玉蜗牛糖胺聚糖的分离纯化及结构表征

王玭，宁子陌，时响，高娜，赵金华

(中南民族大学 药学院,民族药学国家级实验教学示范中心，武汉 430074)

糖胺聚糖(glycosaminoglycan, GAG)是一类由己糖醛酸(或己糖)和氨基己糖交替连接而成的多糖类化合物.常见的GAG有硫酸软骨素、硫酸角质素、硫酸乙酰肝素、肝素(heparin, HP)、透明质酸等.其中，肝素是由氨基葡萄糖(GlcNAc)和艾杜糖醛酸IdoA(90%)或葡萄糖醛酸(GLcA)(10%)以α1,4 糖苷键交替连接形成，且存在N-硫酸基，O-硫酸基以及N-乙酰化等多种结构修饰[1]，因此其一级结构较为复杂.肝素因含有与抗凝血酶III特异性结合的特殊的戊糖序列而具有强效的抗凝抗血栓活性，另外，肝素还具有抑制肿瘤生成与转移、抑制血管生成、抗炎等多种生物活性[2].

上世纪90年代，Kim等[3]首次从非洲大蜗牛(Achatinafulica)体内分离出一种新型的糖胺聚糖，是由GlcNAc与IdoA2S通过α(1→4)糖苷键连接的糖胺聚糖，其化学结构近似肝素及硫酸乙酰肝素而更为规则，该GAG不具有抗凝血活性，而具有抗炎、抑制血管生成、抑制肿瘤生长、抑制成纤维细胞生长因子FGF-2活性等显著的药理活性[4].白玉蜗牛(Achatinafulica)属柄眼目玛瑙螺科，是非洲大蜗牛的白化亚种，是我国已大量人工养殖的陆生贝壳类食材，具有丰富的营养成分和广泛的医药保健价值.本文以白玉蜗牛肉为原料，对其所含的糖胺聚糖(AFG)进行提取纯化，采用具有糖苷键选择性的β-消除解聚法对AFG进行解聚，分析AFG单糖组成和硫酸羧酸摩尔比，结合AFG及dAFG的理化性质及波谱分析法解析其基本化学结构，为阐明其构效关系及药理机制奠定基础.

1 实验仪器与材料

1.1 仪器

电导率仪(DDSJ-308A，上海仪电)，紫外可见光分光光度计(UV2450，Shimadzu公司)，全自动数字旋光仪(Autopol IV-T，美国Rudolph)，傅立叶变换中红外光谱仪(Tracer-100，日本岛津)，超导核磁共振仪(Advance Ⅲ 600MHz，瑞士布鲁克)，高效液相色谱仪(Agilent1260，美国安捷伦).

1.2 实验材料与试剂

白玉蜗牛(Achatinafulica)，购于湖北逸锋白玉蜗牛养殖专业合作社.

Sephadex G10(GE, 美国)，Amberliter FPA98(Cl-)阴离子树脂(罗门哈斯,美国)，阳离子交换树脂[Dowex×50 W×8 100～200(H)，陶氏，美国].

碱性蛋白酶(20 万单位/g，索莱宝)，30% H2O2、三氯甲烷、五氧化二磷、N,N-二甲基甲酰胺、氯化苄、金属钠(AR，国药集团)；L-艾杜糖醛酸(IdoA，上海源叶)，L-(-)-半乳糖(Gal)、1-苯基-3-甲基-5-吡唑啉酮(PMP)、三氟乙酸(阿拉丁)，1,9-二甲基亚甲蓝(DMMB)、D-葡萄糖(Glc)(Sigma)，D-半乳糖胺盐酸盐(GalN·HCl)、苄索氯铵(麦克林)，氨基葡萄糖(GlcN)(上海荣泰制药).

2 实验方法

2.1 AFG的提取纯化

取干燥白玉蜗牛肉(去内脏)800 g粉碎，主要提取纯化步骤如下[5].

酶解：加入10倍量去离子水，搅拌，50 ℃下加入碱性蛋白酶(终浓度为1%)，并缓慢加入6 mol/L NaOH保持pH在9左右，酶解24 h.

碱解：加入6 mol/L NaOH至终浓度为0.5 mol/L，50 ℃碱解2 h，冷却至室温，6 mol/L HCl 调pH 至中性，静置过夜，离心去沉淀.上清加入95%食用乙醇至终浓度为60%，静置过夜，离心得沉淀.

脱色：沉淀用5倍量去离子水溶解，加入30 % H2O2使其终浓度为3 %，pH 保持在10左右，50 ℃脱色2 h，冷却至室温后，6 mol/L HCl 调pH 至中性，离心去沉淀，得脱色液.

盐析醇沉：脱色液加入95%食用乙醇以终浓度为40%和60%分级醇沉.60%醇沉的沉淀即为粗多糖.

纯化：粗多糖用去离子水溶解，10 kDa超滤脱盐后，缓慢加62.5 mg/mL 苄索氯铵溶液，搅拌，静置过夜后离心去上清.沉淀加入等体积的饱和氯化钠，混匀过夜，加入95%食用乙醇以终浓度为60%醇沉，离心继续加饱和氯化钠，此过程进行3次，最终沉淀水溶，过滤，10 kDa超滤脱盐.截留液浓缩后上样于FPA98(OH-)强阴离子交换柱，用H2O、0.3 mol/L NaCl、0.5 mol/L NaCl、0.8 mol/L NaCl依次进行洗脱，0.8 mol/L NaCl洗脱流份用10 kDa超滤脱盐，冻干，得酸性多糖组分AFG.

2.2 AFG的 β-消除解聚

季铵盐转化：精密称取AFG 0.1002 g，将其溶于3.5 mL去离子水中，再精密称取苄索氯铵0.2658 g，溶于4.0 mL去离子水中.将苄索氯铵溶液缓慢加入至AFG溶液中，振荡混匀后静置12 h，次日离心(4700 r/min，20 min)，弃上清液得沉淀.沉淀以3.0 mL去离子水洗涤两次后以五氧化二磷为干燥剂，在40 ℃真空干燥箱中干燥至恒重，得AFG季铵盐0.1822 g.

羧基酯化：取1.5 mL DMF加入上述所得到的AFG季铵盐中，使其溶解.再向其中加入60 μL氯化苄溶液，置于磁力搅拌器上，于35 ℃密闭反应25 h，待反应结束后降温至25 ℃.

β-消除解聚：取0.5 mL新配制的0.16 mol/L的乙醇钠乙醇溶液加入上述反应溶液中，反应30 min.将溶液转移至离心管中，加入1.82 mL饱和氯化钠溶液，再加入14.56 mL无水乙醇终浓度为80%(v/v)醇沉.离心(4700 r/min，10 min)，沉淀继续交换2次，弃上清取沉淀.将上述沉淀用4.0 mL去离子水溶解，加入6.0 mol/L的NaOH溶液67.8 μL至其浓度为0.1 mol/L，在室温下反应30 min，用6.0 mol/L HCl中和，G10凝胶柱层析脱盐，冻干得解聚产物dAFG.

2.3 AFG和dAFG的理化性质分析

2.3.1 紫外-可见分光光度法(UV-Vis)

分别精密称取AFG和dAFG 1 mg，配制成1 mg/mL的水溶液，在190～400 nm波长范围进行扫描.

2.3.2 高效凝胶色谱法(HPGPC)

分别精密称取AFG和dAFG 1 mg，配制成1 mg/mL的水溶液，经0.45 μm 微孔滤膜过滤后，进行HPGPC分析，记录色谱图.色谱条件：Shodex OHpak SB-804 HQ 色谱柱；柱温，35 ℃；流动相为0.1 mol/L氯化钠溶液；流速为0.5 mL/min；进样量为50 μL；检测器为示差检测器RID.

2.3.3 分子量测定

分别称取10 mg AFG和肝素钠，采用SEC-RI-MALLS联用技术测定AFG的分子量及分子量分布，委托北京理化测试中心完成[6].

依次称取系列分子量右旋糖酐标准品，配制成浓度为10 mg/mL的0.1 mol/L NaCl 溶液，0.45 μm滤膜过滤，进样量为20 μL，数据采用GPC软件处理，绘制标准曲线，用标定分子量的AFG进行校正，既得宽标校正曲线.可用于dAFG的分子量及其分布检测.

2.3.4 易染性分析

取AFG和肝素钠各1 mg，加水溶解为1 mg/mL的溶液，各取100 μL的AFG、肝素钠溶液和去离子水，加2 mL 1,9-二甲基亚甲蓝溶液[7]，涡旋混匀2 min，扫描190～800 nm 波长范围的紫外光谱(UV).

2.3.5 比旋光度分析

依2015 版《中国药典》第四部通则部分所述检测旋光度的方法，将AFG和dAFG样品均配成浓度为1 mg/mL 的溶液，测定方法：钠单色光源(λ 589.3 nm)，在 20 ℃下使用全自动数字旋光仪测定其旋光度，在同一条件下检测3次，取其平均值，得比旋光度.

2.4 AFG化学组成检测

2.4.1 1-苯基-3-甲基-5-吡唑啉酮(PMP)衍生化法分析单糖组成[8]

完全酸水解：取AFG 约1 mg，加水溶解至浓度为 2 mg/mL，取该溶液 500 μL加入 4 mL具塞试管中，加入 500 μL 4 mol/L的三氟乙酸溶液，充N2，封管，110 ℃水解4 h，取出水解液，于70 ℃水浴锅中蒸干期间加入1 mL 甲醇以除去多余的三氟乙酸，共加3次甲醇，最后一次蒸干后，样品加入100 μL水溶解，作为供试品溶液.

PMP衍生化：供试品溶液中加入 100 μL 0.6 mol/L 的氢氧化钠溶液和 200 μL 0.5 mol/L 的PMP 甲醇溶液，涡旋混匀；70 ℃衍生化反应 60 min；反应结束后冷却至室温，加入 200 μL 0.3 mol/L 的盐酸溶液进行中和，用 1 mL 三氯甲烷萃取 3 次，水相部分经0.22 μm微孔膜过滤供HPLC分析.另取单糖标准品(Glc、Gal、GlcN.HCl、GalN.HCl、IdoA)适量，加 1mL 水溶解，作为对照溶液，进行PMP衍生化反应.

HPLC色谱条件：Eclipse Plus C18(4.6 mm× 250 mm，5 μm，Agilent, USA)色谱柱；柱温：30 ℃；流动相：0.1 M PBS(pH 6.7)-乙腈(83∶17)；流速：1.0 mL/min；检测波长：245 nm，进样量：20 μL.

2.5 AFG和dAFG的波谱分析

2.5.1 红外光谱(IR)分析

取AFG及dAFG 2 mg经40 ℃真空干燥 24 h，利用KBr压片法压片，傅立叶变换红外光谱仪Tracer-100对AFG样品进行4000～400 cm-1扫描，记录光谱图.

2.5.2 核磁共振波谱(NMR)分析

分别取AFG及dAFG约5 mg，溶于 0.5 mL D2O 中，冷冻干燥，D2O 交换3次后，将样品溶于 0.5 mL D2O中，于25 ℃下使用 Bruker Advance 600 MHz 核磁共振波谱仪检测1H/13C NMR谱图.

3 结果与分析

3.1 AFG的提取与纯化

采用酶解-碱解处理法提取白玉蜗牛粗多糖[5]，继而以等电点法除蛋白质、过氧化氢处理脱色，继而以醇沉处理获得粗多糖.采用季铵盐沉淀法和阴离子交换柱层析法对所得粗多糖(图1a)进行进一步纯化，获得均一性的酸性粘多糖AFG，其HPGPC色谱图(图1b)呈单一色谱峰，面积归一化法计算AFG的纯度大于99 %.

图1 白玉蜗牛粗多糖(a)、AFG(b)的HPLC图及AFG的紫外吸收光谱(c)

AFG的紫外吸收光谱(图1c)显示，该糖胺聚糖仅具有210 nm处的末端吸收，在 260 nm 和 280 nm处无明显吸收峰，表明该AFG中基本不含蛋白质和核酸类杂质.

3.2 AFG的β-消除解聚

β-消除解聚法可选择性断裂连接于糖醛酸C-4位的糖苷键，并在产物的非还原端己糖醛酸中引入Δ4,5不饱和双键[10].该方法首先制备AFG的羧基苄酯化产物，继而在乙醇钠乙醇溶液中进行β-消除解聚，反应产物经后处理得到解聚产物dAFG.

HPGPC(图2a)分析显示，dAFG的保留时间明显延迟，提示其分子量明显降低；紫外吸收光谱(图2b)分析显示，dAFG在234 nm处有最大紫外吸收，表明解聚产物非还原端Δ4,5-不饱和己糖醛酸的形成，该结果与β-消除解聚法的糖苷键选择性解聚特点相符.

图2 dAFG的HPGPC图(a)及紫外吸收光谱(b)

3.3 AFG和dAFG分子量检测

采用分子排阻色谱、示差检测器和多角度激光光散射仪联用技术(SEC-RI-MALLS)可直接测定绝对重均分子量及分子量分布，AFG的Mw(重均分子量)为23.84 kDa，Mn(数均分子量)为21.33 kDa，分散系数Mw/Mn为1.118.AFG的分子量分布较窄，表明AFG为均一性多糖.AFG的Mw高于肝素钠而低于非洲大蜗牛来源GAG[3](表1).

采用GPC软件，根据系列分子量的右旋糖酐标准品绘制标准曲线，使用已知分子量的AFG进行宽标校正，计算dAFG的Mw约为2.00 kDa.

表1 AFG和dAFG的分子量及理化性质测定结果

注：n.d：未检测

3.4 AFG和dAFG的理化性质

3.4.1 易染性分析

酸性多糖可使1,9-二甲基亚甲蓝(DMMB)的最大吸收波长向低波长移动(蓝移现象)，此即酸性多糖的易染性.由于中性多糖不能使DMMB的最大吸收波长蓝移[7]，因此，易染性特征可用于酸性多糖的鉴别.易染性分析结果(图3)显示，与肝素钠一致，AFG可以使DMMB的最大吸收波长蓝移至520 nm，显示其具有酸性多糖的性质.

图3 AFG及肝素的易染性分析紫外扫描光谱

3.4.2 比旋光度

AFG的比旋光度为+75°，为右旋光物质；dAFG的比旋光度为+17°.文献报道[11]小肠粘膜来源肝素的比旋光度为+53°，非洲大蜗牛[3]来源的GAG的比旋光度为+44°.

3.5 AFG的化学组成分析

3.5.1 单糖组成分析

PMP衍生化法分析AFG单糖组成，结果(图4)表明，AFG由氨基葡萄糖(GlcN)和艾杜糖醛酸(IdoA)组成，与非洲大蜗牛来源的GAG相同[3].AFG的色谱图中IdoA信号较低，可能是由于糖醛酸在完全酸水解的条件下发生了糖环断裂，造成了破坏.

图4 AFG单糖组成分析的HPLC图(a, b)及其电导率滴定图(c)

3.6 AFG和dAFG的波谱分析

3.6.1 红外光谱(IR)

AFG和dAFG的红外特征吸收峰基本一致(图5a, b)，以AFG为例，主要有：3429 cm-1强吸收为O-H 的伸缩振动，说明有糖环醇羟基的存在；2928 cm-1为糖环上亚甲基 C-H的伸缩振动；1649 cm-1为O-H的弯曲振动；1261 cm-1为硫酸酯基S=O伸缩振动；1000～1028 cm-1为糖环上 C-O-C 伸缩振动；780～810 cm-1为吡喃环骨架的振动；1417.68 cm-1为艾杜糖醛酸羧基上的C-O 伸缩振动.

3.6.2 AFG和dAFG的核磁共振波谱

AFG的1H NMR谱图如图5d所示.与文献报道的非洲大蜗牛来源的GAG的谱图比较[3]，2.0 ppm处的峰为GlcNAc的甲基信号(A8)，在4.9～5.0 ppm应为两个糖环端基氢信号，其中4.9 ppm处为GlcNAc的端基氢(A1)，5.0 ppm处为IdoA2S的端基氢(U1)，其积分比值提示IdoA2S与GlcNAc的摩尔比为1∶1.

dAFG的1H和13C NMR如图5e、f，与原型AFG相比，在约5.9 ppm处新出现了一组信号峰，根据文献[3]归属为不饱和糖醛酸的4位H，说明在产物的非还原端形成了不饱和糖醛酸(图5c)，5.4 ppm处为不饱和糖醛酸的1位H，4.9～5.2 ppm范围内为其他糖环上的1位氢，位于高场的1.9 ppm 左右为GlcNAc的甲基氢的信号，而在 3.5～4.0 ppm 之间的为糖环上其他质子信号峰.根据文献资料[12]，对碳信号进行了初步归属，25 ppm为GlcNAc甲基碳信号，在90～105 ppm范围内为各个糖环上的端基碳信号，不饱和糖醛酸(ΔU)的C1峰出现在约99.4 ppm，C4的化学位移约为 108.6 ppm，C5的化学位移约为 147.1 ppm，176～180 ppm处为糖醛酸上的羧基碳和GlcNAc的羰基碳信号.其位于非末端的单糖的1H/13C NMR 信号与原型AFG信号特征基本一致，即除了非还原性端的结构变化之外，β-消除解聚过程中，AFG的其他结构可基本保持稳定.

图5 AFG及dAFG的IR(a, b)，1H NMR(d, e)谱图和dAFG的13C NMR(f)谱图及化学结构(c)

4 结语

从白玉蜗牛中分离纯化了均一的酸性多糖AFG，得率为0.88%，其Mw为23.84kDa，通过理化分析及波谱检测可以判断，AFG是由等摩尔的氨基葡萄糖GlcNAc和2位硫酸酯基取代的艾杜糖醛酸(IdoA2S)通过α(1→4)糖苷键交替连接而成，与非洲大蜗牛来源GAG结构基本一致.与哺乳动物来源的肝素和硫酸乙酰肝素相比，AFG的结构相对规则.糖苷键选择性的β-消除解聚法解聚显示，除糖苷键裂解外，其他基本结构稳定，其确切结构可进一步通过纯化寡糖确证，即利用bottom-up策略研究AFG的确切结构.

在药理学活性研究方面，与肝素对比，AFG不存在特异性结合AT的五糖序列，故在高浓度下不具有抗凝活性[4, 5].He等[13]报道非洲大蜗牛和黄蛞蝓来源的GAG均具有较强的乙酰肝素酶抑制活性(IC50,～ 0.25 μmol/L).乙酰肝素酶是内源性的β-D-葡萄糖醛酸内切酶，在体内能够降解硫酸乙酰肝素蛋白聚糖的侧链硫酸乙酰肝素，与多种生理病理过程紧密相关，包括组织修复、炎症反应、肿瘤生长和转移以及血管生成等[14].白玉蜗牛来源的AFG具有与其相似的化学结构，可进一步采用HTRF法[13]系统分析AFG对乙酰肝素酶抑制作用，并探讨抑制乙酰肝素酶的构效关系.