响应面法优化亚临界萃取金丝小枣工艺

何峰，刘伟，袁琳，冯文宁，王刘胜，赵晖*

1. 河北中烟工业有限责任公司技术中心（石家庄 050051）；2. 广东中烟工业有限责任公司技术中心（广州 510385）

金丝小枣其名源于其成熟后掰开时清晰可见的果肉之间缕缕相连晶莹剔透的糖丝。金丝小枣又名西河红枣，是一种具有独特风味的枣中珍品[1]，品种具有20余种，皮薄肉厚，核小汁多，香甜可口，且富含糖类、维生素、氨基酸、生物碱、黄酮和多肽等成分，可降血脂、血压和胆固醇，保肝护肝，增强免疫力，具有一定的抗氧化性和免疫活性[2-8]。

亚临界液体萃取（SLE）是一种以高饱和压力下的液体作为溶剂，在亚临界状态与待分离物质接触，使其依次按极性大小、沸点高低、分子量大小把成分选择性萃取出来的技术。作为一种绿色环保技术在天然植物提取领域内得到广泛而深入研究[9-18]。国内未见采用亚临界萃取金丝小枣的提取工艺，试验旨在建立一种亚临界萃取金丝小枣萃取物新工艺，并采用中心组合试验设计-响应面法对其进行优化，为开发一种新的萃取金丝小枣萃取物工艺提供理论基础。

1 材料与方法

1.1 原料与仪器

金丝小枣（河北沧州）；无水乙醇、丁烷、四氟乙烷等（均为分析纯）。

1.2 仪器及设备

CBE-50+1L亚临界萃取设备（河南省亚临界生物技术有限公司）；RE-52AA型旋转蒸发器（上海亚荣生化仪器厂）；SHB-I11循环水式真空（郑州长城科工有限公司）；6890N/5973N气相色谱-质谱联用仪（美国Agilent公司）；100 μm聚二甲基硅氧烷SPME纤维头（美国Supelco公司）；AB204-S电子天平（瑞士Mettler Toledo公司）。

1.3 流程与方法

1.3.1 试验流程

1.3.2 试验方法

用蒸馏水将金丝小枣冲洗干净后放入烘箱，40 ℃烘干，除去枣核后，用粉碎机将其粉碎，过30目筛，用天平精确称取500 g，放入亚临界萃取器中进行萃取，收集金丝小枣萃取物，进行GC/MS分析，并采用色谱峰面积归一化法，并根据lgA分别考察单因素料液比、次数、时间、压力和温度对萃取效果的影响。

GC/MS分析条件：

气相色谱（GC）分析条件：HP-5弹性石英毛细管柱（50 m×0.32 mm×0.52 μm）；进样口温度250℃；进样量1.0 μL；载气，氦气（纯度＞99.99%）；柱流速1.0 mL/min；分流比5∶1。升温程序：50 ℃保持1 min，以2 ℃/min升至150 ℃，以5 ℃/min升至250℃保持5 min，以10 ℃/min升至280 ℃后运行5 min；传输线温度280 ℃。质谱（MS）分析条件：离子源，EI源；电离能量70 eV；离子源温度230 ℃；四极杆温度150 ℃；质量扫描范围30～550 amu；标准谱库，HP WILEY6.L和NIST98.L。

1.3.3 金丝小枣提取工艺优化

采用Box-Behnken的中心组合设计原理优化金丝小枣提取工艺。在1.3.2的基础上，采用Box-Behnken中心组合设计法选取3个因素作为主自变量，将金丝小枣萃取量作为响应值，对其提取工艺进行优化设计。

2 结果与讨论

2.1 单因素试验结果

2.1.1 料液比的影响

图1中显示金丝小枣的萃取量随液料比的变化趋势。结果表明，随着溶剂增加，萃取量不断提高，且在液料比3∶1 mL/g之后，随溶剂量增加提高不显著。但随着溶剂增加，给后处理工序增加困难，延长溶剂回收时间，使生产效率降低，增加试验成本。因此综合考虑，在保证萃取效果的同时，尽量减少成本，故选择液料比3∶1 mL/g为宜。

图1 液料比对萃取量的影响

2.1.2 萃取时间的影响

图2中显示金丝小枣的萃取量随着不同萃取时间的变化趋势。结果表明，萃取效率随着时间延长呈上升趋势，30 min时，萃取效果变化显著，之后变化效果较小。因此，综合考虑试验成本及萃取时间对萃取效果的影响等因素，故选择萃取时间30 min为宜。

2.1.3 萃取次数的影响

图3中显示金丝小枣的萃取量随着不同萃取次数的变化趋势。结果表明，萃取效率随着次数延长呈上升趋势，在2次时萃取效果变化显著，故选择萃取次数2次为宜。

图2 萃取时间对萃取量的影响

图3 萃取次数对萃取量的影响

2.1.4 萃取温度的影响

图4中显示金丝小枣的萃取量随着不同萃取温度的变化趋势。结果表明，萃取效率随着温度延长呈上升趋势，萃取温度30 ℃时，萃取效果变化显著，之后变化效果较小。因此，综合考虑试验成本及萃取温度对萃取效果的影响等因素，故选择萃取时间30 ℃为宜。

图4 萃取温度对萃取量的影响

2.1.5 萃取压强的影响

图5中显示金丝小枣的萃取量随着不同压强的变化趋势。结果表明，萃取效果随着时间延长呈上升趋势，0.4 MPa时萃取效果显著，故选择萃取压强0.4 MPa。

2.2 中心组合设计试验及结果分析

2.2.1 因素及水平的选取

综合2.1的试验结果，萃取温度和压力对金丝小枣萃取量变化不显著，因此，响应面试验中不作为评价因素进行条件优化。故选取料液比、萃取次数和萃取时间为考察因素，萃取量lgA响应值，采用Design-Expert 8.0.5b统计分析软件进行三因素三水平数据拟合，因素与水平见表1。

图5 萃取压力对萃取量的影响

表1 响应面分析因素与水平表

2.2.2 Box-Behnken试验与结果

单因素试验确定了液料比、萃取时间和萃取次数3个因素，依据BBD试验设计原理，利用Design-Expert 8.0.5b设计三因素三水平共17个试验点的响应面分析试验，并将Z1、Z2和Z3作如下变换：A=（Z1-3）/1，B=（Z2-30）/10，C=（Z3-2）/1，以A、B、C为自变量，以萃取率（Z）为响应值，按表2试验号进行试验，得到回归分析表（表3）和响应面分析3D曲面图（图6～图9）。

响应值与各因素进行回归拟合后，得到回归方程为：Z=6.98+0.44A+0.016B+0.42C-0.54AB+0.23AC-0.22BC-0.93A2-0.33B2+0.093C2（R2=0.955 8）。其中，A，料液比；B，萃取时间；C，萃取次数。

模型的可靠性可从方差分析及相关系数进行考察。由方差分析可知，模型的F=16.83，回归决定系数R2=0.955 8，p=0.000 6＜0.001，表明响应值拟合度，即所采用的二次方程模型极具显著性，表明试验设计可靠。失拟项可反映所用模型和试验拟合的程度即二者的差异程度，而试验失拟项p=0.274 0＞0.05，表明无失拟因素存在，因此可用该回归方程代替试验真实点对试验结果进行分析。从表3中各个p值可以看出，对萃取结果的影响排序依次为料液比、萃取次数和时间。

表2 响应面分析方案及试验结果

表3 Box-Behnken试验结果分析

图6 响应面优化工艺模型等高线叠加图

图7 液料比和萃取时间对萃取率的交互影响

图8 萃取次数和萃取时间对萃取率的交互影响

图9 液料比和萃取次数对萃取率的交互影响

2.2.3 因素间的交互影响

图6～图9直观反映各因素间的交互作用对响应值的影响，液料比和萃取次数对金丝小枣萃取效果的交互效应最为显著，其次是液料比和萃取时间，最后为萃取时间和萃取次数，曲线图由陡峭逐渐向平滑过渡。

2.3 金丝小枣提取工艺条件确定及验证

通过Design-Expert 8.0.5b统计分析软件分析可得，模型的极值点：A=0.098，B=0.399，C=0.975。经转换可得到最优提取条件为：液料比3.1∶1（mL/g）、萃取时间34 min、萃取次数3次、最大萃取率Z=7.39%。通过对最优条件进行实验室验证，得到萃取率为7.36%，表明响应面法能够较好的对亚临界萃取金丝小枣的提取工艺进行回归分析和优化，与实际情况符合度很好。

3 结论

试验以95%的乙醇溶液为萃取溶剂，建立一种亚临界萃取金丝小枣的新工艺，并采用中心组合试验设计-响应面法对其进行优化。依据回归分析确定的最优提取工艺为：萃取溶剂95%乙醇溶液、萃取温度40 ℃、萃取压力0.4 MPa、液料比3.1∶1（mL/g）、萃取时间34 min、萃取次数3次。此时最大萃取率为7.39%。试验验证萃取率为7.36%，表明通过响应面法建立一个较好的预测试验结果的二次方程模型。