不同直径紫苏梗含量及特征图谱比较研究

田清清，张雪兰，张志鹏，梁志毅，方朝缵，魏梅

(广东一方制药有限公司/广东省中药配方颗粒企业重点实验室，广东 佛山 528244)

紫苏梗为唇形科植物紫苏Perillafrutescens(L.)Britt.的干燥茎，秋季果实成熟后采割，呈方柱形，直径0.5～1.5 cm[1]。紫苏梗中含有多种化学成分，包括酚酸类、苯丙酸类、黄酮类、萜类、芳香族、脂肪族等[2]，其中酚酸类成分主要为迷迭香酸、咖啡酸，具有抗过敏、抗氧化、抗感染、抗菌、抗肿瘤、保肝、抗抑郁、降血压、降血脂等药理作用[3]。

中药材商品规格等级是衡量药材质量优良的标准，是影响中药市场价格的重要因素，对质量信息的市场传递具有重要作用[4-5]。邓哲等[6]统计药材规格等级与指标成分或有效成分的关系，川芎、羌活、苍术、茯苓、味连、天麻、太子参等商品规格等级与指标成分成正相关； 牡丹皮药材按长度和粗细分等级，发现芍药苷质量分数与等级呈负相关，而丹皮酚质量分数与等级呈正相关； 白芍、桔梗、远志、大黄、西洋参等商品规格等级与指标成分不相关。仅以指标成分或有效成分划分药材规格等级，具有一定的局限性，中药指纹图谱或特征图谱[7-9]具有稳定性、系统性的特点，可较为全面反映中药所含化学成分的种类和数量，增加特征图谱的研究有利于药材规格等级的划分。茎类药材主要按照加工方法、是否野生、长度、直径等与大小性状相关指标划分等级[10]，因此，本研究建立UPLC法同时测定不同直径紫苏梗中咖啡酸和迷迭香酸的质量分数及特征图谱，并比较其差异性，为紫苏梗规格等级的划分和药材质量控制提供实验依据。

1 仪器与材料

Waters H-Class型超高效液相色谱仪(美国Waters公司)； 111B型二两装高速中药粉碎机(浙江瑞安市永历制药机械有限公司)； XP26百万分之一天平(Mettler Toledo)； ME204E万分之一天平(Mettler Toledo)； JJ2000B型电子天平(常熟市双杰测试仪器厂)。

咖啡酸对照品(批号：110885-201703，纯度99.7%，中国食品药品检定研究院)、迷迭香酸对照品(批号：111871-201706，纯度90.5%，中国食品药品检定研究院)； 液相用甲醇、甲酸、乙腈为色谱级(默克股份有限公司)； 水为超纯水(默克股份有限公司，Milli-Q Direct)； 其余试剂均为分析纯。

10批紫苏梗药材(编号S1-S10)经广东一方制药有限公司魏梅主任药师鉴定为唇形科植物紫苏Perillafrutescens(L.)Britt.的干燥茎，产地分别来自湖南、广西、广东等地。根据紫苏梗茎横切面直径大小，每批紫苏梗药材都划分为4类，以a、b、c、d分别表示直径0.1～0.5 cm、直径0.5～1.0 cm、直径1.0～1.5 cm、直径1.5～3.0 cm，10批紫苏梗药材根据不同直径划分为40份样品，分别编号为样品a1～a10、b1～b10、c1～c10、d1～d10。

2 方法与结果

2.1 色谱条件

色谱柱：ACQUITY UPLC BEH C18色谱柱(100 mm×2.1 mm，1.7 μm)，流动相：乙腈(A)-0.1%甲酸溶液(B)梯度洗脱(0～6 min，10%～18%A； 6～15 min，18%～50%A； 15～15.01 min，50%～10%A； 15.01～20 min，10%A)； 流速：0.4 mL/min； 柱温：30 ℃，检测波长：330 nm，进样量：2 μL。

2.2 溶液配制

2.2.1 对照品溶液的制备 精密称取咖啡酸对照品适量，置10 mL量瓶中，加甲醇溶解至刻度，得到咖啡酸储备液浓度为157.4 μg/mL，备用； 精密称取迷迭香酸对照品适量，置10 mL量瓶中，加甲醇溶解至刻度，得到迷迭香酸储备液浓度为350.8 μg/mL，备用。精密移取咖啡酸储备液2.0 mL及迷迭香酸储备液5.0 mL，置10 mL量瓶中，加甲醇溶解至刻度，即得对照品母液。

2.2.2 供试品溶液的制备 精密称取紫苏梗粉末(过三号筛)0.5 g，置150 mL具塞锥形瓶中，精密加入80%(体积分数，下同)甲醇25 mL，加热回流提取45 min，放冷，离心，取上清液，得到第1次提取液； 药渣继续精密加入80%甲醇25 mL，同法操作，得到第2次提取液，合并2次上清液，加80%甲醇定容至50 mL，摇匀，经0.22 μm微孔滤膜滤过，即得。

2.3 方法学考察

2.3.1 线性关系 分别精密吸取“2.2.1”项下的对照品母液0.1、0.2、0.5、1.0、2.0、5.0 mL，加甲醇定容至10 mL，按“2.1”项下色谱条件进样测定，以对照品质量浓度为横坐标，峰面积为纵坐标，进行线性回归。咖啡酸线性回归方程为：Y=13 676X+209.3，r=1.000 0，结果表明咖啡酸质量浓度在0.31～31.48 μg/mL内与峰面积线性关系良好； 迷迭香酸线性回归方程为：Y=7 848X+374.5，r=1.000 0，结果表明咖啡酸质量浓度在1.75～175.4 μg/mL内与峰面积线性关系良好。

2.3.2 精密度试验 精密吸取“2.2.1”项下对照品母液，按“2.1”项下色谱条件平行进样6次，咖啡酸与迷迭香酸总峰面积的RSD值为0.48%； 以迷迭香酸峰为参照峰，计算各特征峰相对保留时间及相对峰面积，RSD值均小于2%，结果表明该仪器精密度良好。

2.3.3 重复性试验 取同一批紫苏梗粉末，精密称定，平行称定6份，按“2.2.2”项下方法制备供试品溶液，按“2.1”项下色谱条件进样测定，计算供试品溶液中咖啡酸与迷迭香酸总质量分数，RSD值为0.91%； 以迷迭香酸峰为参照峰，计算各特征峰相对保留时间及相对峰面积，各色谱峰相对保留时间的RSD值小于 1%、相对峰面积的RSD值小于2%，结果表明该分析方法重复性良好。

2.3.4 稳定性试验 取同一批次紫苏梗粉末，精密称定，按“2.2.2”项下方法制备供试品溶液，按“2.1”项下色谱条件，在0、1、2、4、6、8、12 h分别进样测定，测得供试品溶液中咖啡酸与迷迭香酸总峰面积的RSD值为0.42%； 以迷迭香酸峰为参照峰，计算各特征峰相对保留时间及相对峰面积，实验结果表明，12 h内各色谱峰相对保留时间的RSD值小于1%、相对峰面积的RSD值小于2%，结果表明供试品溶液在12 h内稳定。

2.3.5 加样回收率试验 取同一批次紫苏梗粉末(咖啡酸质量分数为0.157 mg/g，迷迭香酸质量分数为2.337 mg/g)，精密称定，分别精密加入一定量的咖啡酸与迷迭香酸对照品，按“2.2.2”项下方法制备供试品溶液9份，按“2.1”项下色谱条件分别进样测定，计算咖啡酸与迷迭香酸加样回收率及RSD值，结果见表1。咖啡酸平均加样回收率为93.73%，RSD值为2.21%，迷迭香酸平均加样回收率为93.19%，RSD值为2.69%，表明回收率良好。

表1 紫苏梗的加样回收率试验结果Table 1 Results of recovery test of Perillae Caulis (n=9)

2.3.6 耐用性试验 按“2.2.2”项下方法制备供试品溶液，按“2.1”项下色谱条件进样2 μL，计算咖啡酸与迷迭香酸总质量分数，选择Agilent SB C18-1、Agilent SB C18-2、ACQUITY UPLC BEH C18色谱柱，RSD值为2.97%； 选择不同柱温时，RSD值为0.46%； 选择不同流速时，RSD值为0.57%，均能达到系统适用性要求。

2.4 不同直径紫苏梗质量分数的测定

2.4.1 不同直径紫苏梗质量分数的测定 分别取10批不同直径紫苏梗药材(样品a1～a10、b1～b10、c1～c10、d1～d10)，按“2.2.2”项下方法制备供试品溶液，按“2.1”项下色谱条件测定，计算不同直径紫苏梗中的咖啡酸和迷迭香酸质量分数，结果见表2。可见，a规格样品的咖啡酸质量分数显著高于b、c、d规格，迷迭香酸质量分数显著高于c、d规格； b规格样品的咖啡酸质量分数显著高于c、d规格； c、d规格中，咖啡酸和迷迭香酸质量分数差异无统计学意义。

d/cm咖啡酸/(g·mg-1)迷迭香酸/(g·mg-1)0.1～0.50.106±0.007a1.278 ±0.356a0.5～1.00.090±0.009b0.916±0.196ab1.0～1.50.070±0.163c0.572±0.309b1.5～3.00.065±0.125c0.710±0.145b

注：同一行中相同字母表示在0.05水平上差异无统计学意义；不具或具不同字母表示在0.05水平上差异有统计学意义。

2.4.2 主成分分析(PCA) 采用Past 3.0软件对10批不同直径紫苏梗的迷迭香酸、咖啡酸质量分数数据进行主成分分析，建立PCA模型，绘制的二维得分散点图见图1。可见，10批紫苏梗不同直径大小共40个样本分为2类，由于紫苏梗不同批次间存在一定差异性，除个别样品b10、c10有交叉，其余样品直径<1.0 cm(a和b)聚为一类，直径>1.0 cm(c和d)聚为一类。

2.5 不同直径紫苏梗的特征图谱

2.5.1 不同直径紫苏梗特征图谱的建立 分别取10批不同直径紫苏梗药材(样品a1～a10、b1～b10、c1～c10、d1～d10)，按照“2.2.2”项下方法制备供试品溶液，按“2.1”项下色谱条件进样测定，并记录色谱图。不同直径紫苏梗的样品数据依次采用“中药色谱指纹图谱相似度评价系统”(2012A)进行评价，分别生成四个直径的UPLC对照图谱，见图2。采用相对保留时间分别从40份紫苏梗样品中标定了15个共有特征峰，通过与对照品比对，确定其中2号峰为咖啡酸、7号峰为迷迭香酸，由于迷迭香酸在各批次不同直径紫苏梗中均有出现，分离度良好且峰面积最大，故选择迷迭香酸为参照峰(S)。

直径0.1～0.5cm直径0.5～1.0cm直径1.0～1.5cm直径1.5～3.0cm0.040.020.00-0.02-0.04-1.0-0.50.00.51.0

图1不同直径紫苏梗主成分分析(PCA)得分图

Figure1PCA score plot of main components of Perillae Caulis with different diameters

403020100U/mVt/min1012141602468

R(a).直径0.1～0.5 cm； R(b).直径0.5～1.0 cm； R(c).直径1.0～1.5 cm； R(d).直径1.5～3.0 cm； A.混合对照品； 2.咖啡酸； 7.迷迭香酸。

图2不同直径紫苏梗药材共有对照特征图谱

Figure2Common control UPLC Characteristic chromatograms of Perillae Caulis with different diameters

2.5.2 不同直径紫苏梗相似度评价 计算样品a1～a10、b1～b10、c1～c10、d1～d10与紫苏梗各直径范围对照特征图谱的相似度，结果见表3。可见，相似度均>0.90，表明相同直径范围的不同批次紫苏梗具有较高的相似度。

2.5.3 方差分析 采用SPSS 20.0软件对40份样本从不同直径进行方差分析，并采用字母标记法进行显著性分析，结果见表4。可见，特征峰2(咖啡酸)、12在0.1～1.0 cm与1.0～3.0 cm直径范围间差异有统计学意义； 特征峰1、3、10、11、14在0.1～1.0 cm与1.5～3.0 cm直径范围间差异有统计学意义； 特征峰6、7(迷迭香酸)、15在0.1～0.5 cm与1.0～3.0 cm直径范围间差异有统计学意义； 特征峰8在0.5～1.5 cm与1.5～3.0cm直径范围间差异有统计学意义； 特征峰13在0.5～1.0 cm与1.0～3.0 cm直径范围间差异有统计学意义； 特征峰4、5、9在各直径范围间差异无统计学意义。由于特征峰2(咖啡酸)、7(迷迭香酸)在15个特征峰中的占比高达11%、60%，故总峰在0.1～1.0 cm与1.0～3.0 cm直径范围间差异显著。

2.5.4 不同直径紫苏梗特征峰比较 以不同直径紫苏梗特征图谱15个特征峰数据进行分析，纵坐标为峰面积/取样量，横坐标为不同直径规格，变化规律见图3。可见，紫苏梗特征峰1、2、3、10、11、12、14、15随直径的增加呈递减趋势； 特征峰4、8、13随直径的增加呈先增后减趋势； 特征峰5随直径的增加而增加； 特征峰6、7随直径的增加呈先减后增趋势； 特征峰9的变化与直径的大小无明显关系。总体来说，紫苏梗特征峰随直径的增加呈递减趋势。

2.5.5 聚类分析(CA) 采用SPSS 20.0软件对数据进行聚类分析，建立10批紫苏梗不同直径大小的聚类分析树状图，结果见图4。可见，可将不同直径紫苏梗共40个样本聚为2类，由于不同批次间样品存在一定差异，除去个别样品(d1、b10、c10)，a与b聚为Ⅰ类，c与d聚为Ⅱ类。综上所述，根据10批不同直径紫苏梗样品特征图谱聚类分析结果，基本可将紫苏梗直径0.1～1.0 cm(a和b)与直径1.0～3.0 cm(c和d)之间区分开。

表3 不同直径紫苏梗药材特征图谱相似度计算Table 3 Similarity calculation of UPLC Characteristic chromatograms of Perillae Caulis with different diameters

表4 不同直径紫苏梗药材方差分析比较结果Table 4 Comparison of variance analysis of Perillae Caulis with different diameters (峰面积/取样量)/(mAu·min·g-1)

注：同一行中相同字母表示在0.05水平上差异无统计学意义；不具或具不同字母表示在0.05水平上差异有统计学意义。

图3不同直径紫苏梗特征峰比较
Figure3Comparison of Characteristic peaks of Perillae Caulis with different diameters

Ⅱ类Ⅰ类0510152025c2c8c5d4d10c3c9c6c1b10d9c4d2d3d6c7d8d7d5a6a8a7b6b8b7a9a10b4a1b1d1a3a4a2a5c10b5b9b2b3

图4不同直径紫苏梗聚类分析(CA)树状图

Figure4CA dendrogram of Perillae Caulis with different diameters

3 讨论

本研究分别考察了甲醇、80%甲醇、乙醇、稀乙醇、60%丙酮5种提取溶剂的提取效率，结果表明，当80%甲醇作为提取溶剂时，色谱峰分离效果好，响应值高； 同时分别考察了超声处理和回流提取2种提取方式及不同提取时间、提取次数，结果表明，回流提取2次，每次45 min时，咖啡酸和迷迭香酸提取较为充分，可作为供试品提取方法。

2015年版《中国药典》及《香港中药材标准》中规定紫苏梗直径应为0.5～1.5 cm；上海、天津、重庆、广西等省、市中药饮片炮制规范中也明确规定了紫苏梗直径应为0.5～1.5 cm；《陕西省中药饮片标准(第二册)》中规定紫苏梗直径为0.2～1.5 cm。中药材规格与等级的划分并非一成不变的，随着时代的发展而不断完善，制定新的规格等级标准，有利于规范市场，提高药材质量，引导优质优价，形成良性循环[4-5,11-12]。《陕西中药志》中收载紫苏梗以茎粗为佳，《现代中药材商品通鉴》中记载以梗嫩为佳。紫苏梗茎的粗细、老嫩受采收时间、生态因子等因素影响，传统“茎粗”“梗嫩”等感官评价难以作为紫苏梗药材流通过程中的质量评价标准。本研究结果表明，紫苏梗直径0.1～1.0 cm与1.0～3.0 cm无论是指标成分质量分数还是特征图谱间的差异均具有统计学意义，紫苏梗直径大小以1.0 cm为界线，基本可划分为2种商品规格等级。因此，结合现有标准，建议以直径大小为指标，将紫苏梗划分为2个等级，即直径0.1～1.0 cm质量较优为第一等级，1.0～3.0 cm质量次之为第二等级。

本文探讨了紫苏梗外观性状中直径大小与内在成分之间的关系，通过测定2个指标成分质量分数以及建立特征图谱，发现紫苏梗的直径大小与咖啡酸、迷迭香酸质量分数呈负相关，猜测紫苏的生产环境以及采收时间一定程度上影响了咖啡酸、迷迭香酸在茎中的累积。虽然研究结果表明紫苏梗直径较小则质量更优，但直径小同时产量也较低，单以直径小的紫苏梗入药不仅容易造成药材资源的浪费，同时影响药农种植的积极性，不利于产业的发展。因此关于紫苏梗直径大小、采收时间与药材质量三者间的关系仍需深入研究，以期为紫苏梗的种植采收提供理论指导。由于紫苏梗药材自身结构组织差异，药效成分分布不同，有的在皮部大量积累，有的却在木部中大量积累，因此以特征图谱作为质量控制具有一定的科学性。本研究综合质量分数测定结合特征图谱，为从紫苏梗直径大小角度制定紫苏梗商品规格等级的标准提供了参考。