miR-182-5p调控FHIT对喉鳞癌细胞增殖、凋亡、迁移、侵袭的影响

王刘中 赵冬丽 桑建中 张亚民 曹华

分子靶向治疗是以影响肿瘤细胞特异性分子作为靶点的治疗方式，可以抑制肿瘤的生长和转移，有望改善头颈部癌的治疗效果[1]。深入研究喉鳞癌的发生发展机制，寻找特异性靶点，可为喉鳞癌的早发现、早治疗提供新方法。微小RNA(microRNA，miRNA)是一类长约18～24个核苷酸的非编码小RNA，研究发现部分miRNA在喉鳞癌中表达失调，影响喉鳞癌的发生发展，因此，miRNA可作为喉鳞癌的分子标志物和治疗靶点[2]。研究发现miR-182-5p在结直肠癌患者直肠粘膜组织中异常高表达，与结直肠癌不良预后呈正相关[3]；miR-182在非小细胞肺癌细胞中过表达可促进细胞生长、集落形成能力和细胞周期进程，并抑制细胞凋亡[4]；miR-182-5p可通过抑制Cofilin 1表达抑制人膀胱癌细胞的增殖，迁移和侵袭[5]。但miR-182-5p对喉鳞癌细胞生物学行为的影响及其机制目前还不清楚。

细胞周期素D1(CyclinD1)是细胞周期从G1期进入S期的重要调控因子，其过表达可造成细胞过度增殖从而促进肿瘤的发生，有研究发现沉默CyclinD1能有效抑制喉癌细胞的生长，并能诱导喉癌细胞凋亡。细胞周期蛋白依赖性激酶抑制剂1A(Cyclin-dependent kinase inhibitor1A，p21)是细胞周期负调控因子，其过表达可阻碍G1/S期转化，研究报道喉癌组织和喉癌细胞系中存在p21基因高甲基化，去甲基化药物5-azacytidine可以通过诱导p21基因启动子CpG岛去甲基化修饰，改变肿瘤细胞细胞周期基因的调控，促进肿瘤细胞凋亡[6]。Bcl-2、Bax是调控细胞凋亡相因子，Bcl-2是抑凋亡因子，Bax是促凋亡因子，姜黄素可通过下调Bcl-2表达及上调Bax表达而诱导喉癌细胞凋亡[7]。基质金属蛋白酶2(matrix metalloproteinase2，MMP-2)高表达可降解细胞外基质，与细胞浸润转移有关，上皮钙黏蛋白(E-cadherin)参与细胞连接和粘附信号的传递，影响细胞迁移，MMP-2在喉鳞癌中高表达，E-cadherin低表达，与肿瘤大小、分化程度、淋巴结转移密切相关[8]。脆性组氨酸三联体(fragile histidine triad，FHIT)基因定位于染色体3pl4.2，是一种候选的抑癌基因，研究发现FHIT在喉癌组织中低表达，可能与喉癌的发展有关，FHIT可能是抑制肿瘤发生的重要因素[9]；还有研究发现FHIT与喉癌细胞淋巴结转移和临床分期相关[10]；但FHIT对喉鳞癌细胞生物学行为的影响尚未清楚。故本实验旨在研究miR-182-5p和FHIT对喉鳞癌细胞生物学行为的影响及miR-182-5p是否通过调控FHIT影响喉鳞癌细胞生物学行为，以期为喉鳞癌的早期诊治提供参考。

1 材料与方法

1.1实验材料

1.1.1喉癌患者喉鳞癌及癌旁组织、喉鳞癌细胞来源 本研究所取喉鳞癌组织和癌旁正常组织各39例，均取自郑州大学第一附属医院确诊的喉癌患者的手术切除样本。喉鳞癌组织均经组织病理检查确诊。39例喉鳞癌患者中，男26例，女13例；年龄37～72岁，平均58岁；Ⅰ期8例，Ⅱ期14例，Ⅲ期11例，Ⅳ期6例。癌旁组织为距离癌组织0.5 cm处组织(病理检查为正常组织)。喉鳞癌细胞FD-LSC-1购自美国ATCC。

1.1.2主要试剂 胎牛血清、RPMI-1640培养基、胰蛋白酶购自美国Sigma公司；Trizol试剂、反转录试剂盒、荧光定量试剂盒、LipofectamineTM2000转染试剂购自美国Invitrogen公司；RIPA蛋白裂解液、二辛可宁酸(BCA)试剂盒、聚偏二氟乙烯膜(polyvinylidene fluoride，PVDF)、十二烷基硫酸钠，钠盐-聚丙烯酰胺凝胶电泳(dodecyl sulfate,sodium salt-Polyacrylamide gel electrophoresis，SDS-PAGE)试剂盒、四甲基偶氮唑盐比色法(MTT)试剂盒、膜联蛋白V-异硫氰酸荧光素(Annexin V-FITC)和碘化丙锭(PI)试剂盒购自上海碧云天生物技术有限公司；抗体购自北京博奥森生物科技有限公司；Transwell小室、Matrigel胶购于美国BD公司；双荧光素酶报告基因检测试剂盒购自北京Solarbio公司。anti-miR-NC、anti-miR-182-5p、miR-NC、miR-182-5p、si-NC、si-FHIT载体质粒购自上海斯信生物科技有限公司。Thermo FC酶标仪购自美国Thermo公司；FACS caliber流式细胞仪购自美国BD公司；荧光倒置显微镜购自日本Olympus公司。

1.2实验方法

1.2.1细胞培养 喉鳞癌细胞FD-LSC-1用含10 %胎牛血清的RPMI-1640培养基于37 ℃恒温培养箱中培养，每天换液一次，待细胞融和至90%左右时，加入胰蛋白酶进行消化传代。

1.2.2细胞处理与分组 取对数生长期喉鳞癌细胞FD-LSC-1无血清培养12 h后更换培养基，将anti-miR-NC、anti-miR-182-5p、miR-NC、miR-182-5p分别转染至FD-LSC-1细胞中，分别记为anti-miR-NC组、anti-miR-182-5p组、miR-NC组、miR-182-5p组；将anti-miR-182-5p质粒分别与si-NC、si-FHIT共转染至FD-LSC-1细胞中，分别记为anti-miR-182-5p+si-NC组、anti-miR-182-5p+si-FHIT组。具体转染步骤按照LipofectamineTM2000试剂盒进行操作。

1.2.3实时荧光定量PCR(real-time quantitative PCR，RT-qPCR)检测miR-182-5p表达水平 取喉鳞癌组织、癌旁组织，anti-miR-NC组、anti-miR-182-5p组细胞，提取总RNA，用反转录试剂盒将RNA反转录成cDNA，按照荧光定量试剂盒使用说明进行PCR，miR-182-5p以U6为内参进行PCR扩增，每个样品设3个重复，循环条件为95 ℃ 5 min，95 ℃ 30 s，60 ℃ 30 s；72 ℃ 30 s，共40个循环；60 ℃延长5 min。相对表达量用2-△△Ct法计算。miR-182-5p上游引物序列：5′-TTTACGCGTGTTGTTGTTGAGACAGAATCTCG CT-3′，下游引物序列：5′-TTTAAGCTTCCT GCCGACCCTGCGGAGAGA-3′；U6上游引物序列：5′-GCTTCGGCAGCACATATACTAAAA-3′，下游引物序列：5′-CGCTTCACGAATTTGCGTGTCAT-3′。

1.2.4蛋白质印迹(Western Blot)检测FHIT、CyclinD1、p21、Bcl-2、Bax、E-cadherin、MMP-2和FHIT蛋白表达水平 各组细胞培养48 h后提取总蛋白，BCA试剂盒测定蛋白浓度。将蛋白样品进行SDS-PAGE电泳90 min后转至聚偏二氟乙烯膜(polyvinylidene fluoride，PVDF)上，100 V进行转膜30～60 min，用5 %脱脂奶粉室温封闭1 h，再分别加入一抗(1∶1 000)，4 ℃孵育过夜，Tris盐吐温缓冲液(tris buffer solution tween，TBST)洗膜；加入二抗(1∶2 000)室温孵育90 min，TBST洗涤3次，每次5 min，后用ECL发光法染色，用ChemiDoc XRS+系统成像，将胶片用Quantity One凝胶分析软件处理，测定各组蛋白条带的吸光度，蛋白相对表达水平=目的条带吸光度值/GAPDH条带吸光度值。每个蛋白样品设3个重复。

1.2.5MTT检测细胞增殖活性 各组细胞分别培养至24、48、72 h时加入20 μl(5 mg/ml)的MTT溶液，37 ℃孵育4 h；弃去培养液，每孔加入150 μl DMSO后振荡反应10 min，使结晶物充分溶解，然后在490 nm波长条件下用酶标仪检测各孔吸光度(OD)值。细胞增殖活性(%)=实验组OD值/空白对照组OD值×100%。实验重复3次，每次设3个复孔。

1.2.6流式细胞术检测细胞凋亡 各组细胞培养48 h后用不含EDTA的胰酶消化，PBS漂洗2次，加结合缓冲液重悬细胞。按照试剂盒说明书，先后加入Annexin V-FITC和PI避光孵育。流式细胞仪检测激发波长488 nm和发射波长530 nm处的荧光强度。实验重复3次，每次设3个复孔。

1.2.7Transwell检测细胞迁移和侵袭 各组细胞培养48 h后用无血清培养基重悬细胞，调整浓度为5×104个/ml。细胞迁移实验：取200 μl细胞悬液接种于Transwell小室上室中，下室加入700 μl含10%胎牛血清的RPMI-1640培养液，培养48 h后取出小室，吸去培养液后用棉签轻轻擦去上层细胞，PBS洗涤，用4 %多聚甲醛固定30 min，清水洗涤2次，再用0.1%结晶紫染色10 min，显微镜观察并拍照，计算结晶紫染色细胞数即为迁移细胞数。细胞侵袭实验：以1∶4比例加入RPMI 1640培养液稀释Matrigel后，包被Transwell小室的上室，室温下干燥凝固后，然后按照细胞迁移实验步骤操作，最后显微镜下观察结晶紫染色细胞数即为侵袭细胞数。

1.2.8荧光素酶报告基因检测miR-182-5p对FHIT的靶向调控 构建野生型和突变型基因靶点FHIT的3′UTR荧光素酶表达载体WT-FHIT和MUT-FHIT，用LipofectamineTM2000将WT-FHIT和MUT-FHIT分别与miR-NC和miR-182-5p共转染至FD-LSC-1细胞中，按照说明书进行检测。实验结果以荧光素酶活性和Renilla活性的比值进行统计学分析，实验重复3次。

2 结果

2.1miR-182-5p、FHIT在喉鳞癌组织和癌旁组织中的表达 喉鳞癌组织和癌旁组织中，miR-182-5p的表达分别为0.25±0.02和0.97±0.10，FHIT的表达分别为0.64±0.06和0.12±0.01，可见与癌旁组织相比较，喉鳞癌组织中miR-182-5p表达水平显著升高，FHIT表达水平显著降低(P<0.001)。

2.2抑制miR-182-5p对喉鳞癌细胞FD-LSC-1增殖、凋亡的影响 与anti-miR-NC组相比较，anti-miR-182-5p组miR-182-5p、Cyclin D1、Bcl-2表达水平显著降低，P21、Bax表达水平显著升高，细胞活性显著降低，细胞凋亡率显著升高(P<0.001)(图1，表1、2)，可见，抑制miR-182-5p表达可抑制喉鳞癌细胞FD-LSC-1的增殖、诱导细胞凋亡。

图1 流式细胞术检测细胞调亡(a)和Westerm Blot检测蛋白表达图(b) a.抑制miR-182-5p可促进FD-LSC-1细胞凋亡;b.抑制miR-182-5p可改变FD-LSC-1细胞中Cyclin D、P21、Bax、Bcl-2蛋白表达

表1 anti-miR-NC组和anti-miR-182-5p组miR-182-5p、Cyclin D1、P21相对表达量及细胞活性

表2 anti-miR-NC组和anti-miR-182-5p组Bax、Bcl-2相对表达量及细胞凋亡率

2.3抑制miR-182-5p对喉鳞癌细胞FD-LSC-1迁移、侵袭的影响 与anti-miR-NC组相比，anti-miR-182-5p组E-cadherin表达水平显著升高，MMP-2表达水平显著降低，细胞迁移和侵袭数显著降低(P<0.001)(图2，表3)。可见，抑制miR-182-5p表达可抑制喉鳞癌细胞FD-LSC-1的迁移、侵袭。

表3 anti-miR-NC组和anti-miR-182-5p组E-cadherin、MMP-2相对表达量及迁移、侵袭细胞数

图2 Western Blot检测抑制miR-182-5p对FD-LSC-1细胞中E-cadherin、MMP-2蛋白的表达

2.4miR-182-5p靶向、调控FHIT Targetscan预测到FHIT与miR-182-5p存在结合位点(图3a)；荧光素酶结果显示，miR-NC组、miR-182-5p组WT-FHIT的喉鳞癌细胞FD-LSC-1的荧光素酶活性分别为1.01±0.10和0.28±0.03，MUT-FHIT的荧光素酶活性分别为0.96±0.10和1.04±0.10，可见，相较于miR-NC组，miR-182-5p组转染WT-FHIT的喉鳞癌细胞FD-LSC-1的荧光素酶活性显著降低(P<0.001)；而转染MUT-FHIT的喉鳞癌细胞FD-LSC-1的荧光素酶活性差异不显著。Western blot检测结果(图3b)显示，miR-NC组、miR-182-5p组、anti-miR-NC组、anti-miR-182-5p组FHIT的表达分别为0.11±0.01、0.05±0.004、0.12±0.01和0.43±0.04；可见相较于miR-NC组，miR-182-5p组FHIT表达水平显著降低；anti-miR-182-5p组FHIT表达水平显著升高(P<0.05)；可见，miR-182-5p可靶向调控FHIT的表达。

图3 miR-182-5p靶向FHIT和Western Blot检测FHIT蛋白表达 a. FHIT的3’UTR含有miR-182-5p的互补序列;b. 蛋白图可见miR-182-5p负调控FHIT蛋白的表达

2.5抑制FHIT影响miR-182-5p对喉鳞癌细胞FD-LSC-1增殖、凋亡的作用 与anti-miR-NC组相比，anti-miR-182-5p组FHIT表达水平显著升高，Cyclin D1、Bcl-2表达水平显著降低，P21、Bax表达水平显著升高，细胞活性显著降低，细胞凋亡率显著升高(P<0.001)；与anti-miR-182-5p+si-NC组相比，anti-miR-182-5p+si-FHIT组FHIT表达水平显著降低，Cyclin D1、Bcl-2表达水平显著升高，P21、Bax表达水平显著降低，细胞活性显著升高，细胞凋亡率显著降低(P<0.001)(表4，5)。可见，抑制FHIT能逆转抑制miR-182-5p对喉鳞癌细胞FD-LSC-1增殖抑制、凋亡促进的作用。

表4 各组Cyclin D1、P21表达量及细胞活性

注：与anti-miR-NC组比较，*P<0.05；与anti-miR-182-5p+si-NC组比较，#P<0.05

表5 各组FHIT、Bax、Bcl-2表达量及细胞凋亡率

注：*:与anti-miR-NC组比较，P<0.001；#:与anti-miR-182-5p+si-NC组比较，P<0.001

2.6抑制FHIT影响miR-182-5p对喉鳞癌细胞FD-LSC-1迁移、侵袭的作用 与anti-miR-NC组相比，anti-miR-182-5p组E-cadherin表达水平显著升高，MMP-2表达水平显著降低，细胞迁移和侵袭数显著降低(P<0.001)；与anti-miR-182-5p+si-NC组相比，anti-miR-182-5p+si-FHIT组E-cadherin表达水平显著降低，MMP-2表达水平显著升高，细胞迁移和侵袭数显著升高(P<0.05)(表6)。可见，抑制FHIT能逆转抑制miR-182-5p对喉鳞癌细胞FD-LSC-1迁移、侵袭的抑制作用。

3 讨论

研究表明，miRNA参与调控肿瘤的恶性生物学行为，如miR-182-5p在前列腺癌组织中表达上调，可促进前列腺癌细胞增殖、侵袭和迁移并抑制细胞凋亡[11]；下调miR-182-5p可通过靶向上调RAB27A显著降低胃癌细胞的活力、迁移和侵袭[13]；这些研究结果说明miR-182-5p低表达具有抑癌作用。本实验结果显示，喉鳞癌组织中miR-182-5p高表达，而抑制miR-182-5p表达后细胞活性和迁移、侵袭数量均显著降低，细胞凋亡率显著升高，说明抑制miR-182-5p表达可抑制喉鳞癌细胞增殖、侵袭和迁移，并促进细胞凋亡。本实验结果还显示，抑制miR-182-5p表达后，CyclinD1、Bcl-2、MMP-2表达水平显著降低，p21、Bax、E-cadherin表达水平显著升高，表明miR-182-5p可能通过调控细胞周期、凋亡、迁移等相关蛋白影响喉鳞癌细胞的增殖、迁移、侵袭和凋亡。

表6 各组E-cadherin、MMP-2表达量及迁移、侵袭细胞数

注：*：与anti-miR-NC组比较，P<0.001；#：与anti-miR-182-5p+si-NC组比较，P<0.001

FHIT是一种肿瘤抑制基因，FHIT在喉鳞癌中低表达，且与临床分期和淋巴结转移有关[13]；高表达FHIT能阻滞细胞周期和诱导细胞凋亡，降低宫颈癌细胞的增殖能力[14]。大量研究表明miRNA通过与其靶基因mRNA的3’UTR区互补结合使之降解或影响mRNA的翻译，实现转录后水平调控。研究发现上调miR-119a通过靶向抑制FHIT的表达促进膀胱肿瘤细胞增殖与迁移[15]。本实验先用Targetscan在线软件预测显示FHIT与miR-182-5p存在结合位点，进一步用荧光素酶报告实验进行验证，结果显示，同时转染miR-182-5p和FHIT野生型载体的喉鳞癌细胞FD-LSC-1的荧光素酶活性显著降低；而同时转染miR-182-5p和FHIT突变型载体的喉鳞癌细胞FD-LSC-1的荧光素酶活性差异不显著，且FHIT的表达水平与miR-182-5p呈负相关。说明FHIT是miR-182-5p的靶基因，miR-182-5p可靶向调控FHIT的表达。本实验同时转染FHIT和miR-182-5p的抑制表达载体后细胞活性和迁移、侵袭的数量均显著升高，细胞凋亡率降低，CyclinD1、Bcl-2、MMP-2表达水平升高，p21、Bax、E-cadherin表达水平降低；说明，抑制FHIT逆转了抑制miR-182-5p对喉鳞癌细胞FD-LSC-1增殖、迁移、侵袭的抑制和凋亡促进作用；进一步表明miR-182-5p可能通过调控FHIT的表达而影响喉鳞癌细胞增殖、迁移、侵袭和凋亡。

综上所述，抑制miR-182-5p表达可抑制喉鳞癌细胞增殖、迁移和侵袭，促进细胞凋亡，其机制可能与FHIT及增殖、迁移、侵袭、凋亡相关蛋白的表达有关，将可为喉鳞癌早期诊断和预后判断提供标记分子，为其分子靶向干预治疗提供潜在的药物靶点。