乳酸菌素plnJ-K蛋白的串联表达

陈立圳, 王全溪, 向思琳, 高玉云, 许丽惠, 王长康

(福建农林大学动物科学学院，福建 福州 350002)

相对于传统养殖业的养殖管理模式，现代畜牧集约化养殖具有规范的管理以及较高的产品产出等优势[1]，但集约化养殖同样有其相对应的缺点.高密度的养殖条件使畜禽更容易受到病原微生物的侵袭，使机体长时间处于应激状态，从而影响畜禽健康[2].抗生素虽然能够有效地控制疾病的发生和传播，但其耐药性以及对环境的污染日趋严重[3].为此，寻找能够保护畜禽健康的替抗营养添加剂显得尤为重要.

正常生理情况下，动物肠道区系微生物与宿主维持着动态平衡，当平衡被打破后，容易诱发各种疾病的产生.因此，维护动物肠道微生态平衡对于机体的健康具有重要的意义.相关研究表明，乳酸菌素能够调整或者维持肠道微生态平衡，具有促进有益菌增殖，抑制有害菌的生长以及增强机体免疫力来预防疾病，从而促进动物生长及提高饲料转化率[4-5]；乳酸菌素能够形成生物屏障，抑制病原菌吸附和侵袭，从而保护动物体的健康，且乳酸菌素具有无耐药性、无残留等优点[6].因此，乳酸菌素可以作为功能性饲料添加剂应用在动物养殖中.

目前，密码子的偏好性已被应用于转基因的研究中，在转基因研究过程中通常需要进行基因的外源表达.但由于大肠杆菌密码子的偏好性，人工转入的外源基因在大肠杆菌中常遇到表达效率低、表达产物不稳定等问题[7].乳酸菌素的表达量受到多种因素的影响，不适宜的温度以及发酵时间会造成菌体蛋白的产量不足[8].先前诸多研究主要集中在其他蛋白表达的研究上，而对优化乳酸菌素表达的研究较少.因此，探究如何提高乳酸菌素的表达具有重要的研究意义.为了更好地提高乳酸菌素plnJ-K在大肠杆菌中的表达效率，本试验采用基因工程技术，通过优化基因序列，构建重组串联质粒PET-32a-pln-J-K，并探究最佳的诱导条件，旨在为乳酸菌素的应用提供依据.

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 质粒与菌株 PET-32a-pln-J-K根据GeneBank已有的序列交由生工生物工程(上海)股份有限公司优化.大肠杆菌购于北京全式金生物技术有限公司.

1.1.2 试剂 His标签抗体、BL21、蛋白质分子质量标准(14～100 ku)、氨苄青霉素、异丙基-β-D-硫代半乳糖苷购于北京全式金生物技术有限公司；SDS-PAGE试剂盒、质粒小提试剂盒、凝胶回收试剂盒购于天根生化科技(北京)有限公司；转膜液、电泳液购于碧云天生物技术公司；PVDF膜购于PALL 公司；BamHⅠ、HandⅢ限制性内切酶购于宝生物公司；考马斯亮蓝R250购于BBI公司；TBST购于北京索莱宝科技有限公司.

1.2 方法

1.2.1 序列优化 根据GeneBank中的plnJ、plnK基因序列，通过大肠杆菌对密码子的偏好性设计并优化plnJ-K基因序列，在序列设计和优化的过程中避免使用稀有密码子和构建重组质粒所需的限制性内切酶位点.优化的野生型基因序列由生工生物工程(上海)股份有限公司合成，并克隆于质粒pUC57中.

1.2.2 优化后序列重组质粒的构建 采用双酶切体系，使用BamHⅠ、HandⅢ限制性内切酶分别酶切载体质粒pET-32a及经过PCR扩增并纯化的目的基因，通过琼脂糖凝胶电泳回收酶切产物，使用20 μL T4连接酶体系进行连接. 于4 ℃过夜后，将连接产物转入DH-5α感受态细胞中，均匀涂布在含氨苄青霉素的LB培养平板上，隔天挑选菌株，经PCR检测及双酶切鉴定，接种到LB液体培养基中，于37 ℃摇菌过夜.将菌液交由生工生物工程(上海)股份有限公司测序.

1.2.3 重组串联表达载体的构建 将重组质粒、大肠杆菌BL21冰浴30 min，随即放入42 ℃恒温水浴锅中热激45 s后，放入冰水中冷却2 min.经过以上步骤之后，将质粒pET-32a-pln-J-K转入大肠杆菌BL21中，于37 ℃恒温摇床上培养1 h.将适量培养液涂布在含氨苄青霉素的LB平板上培养过夜，经过PCR扩增及双酶切鉴定后，接种到LB液体培养基中，于37 ℃摇菌过夜，再将阳性克隆菌保存于-80 ℃下.

1.2.4 诱导温度、时间的优化 将保存的阳性克隆菌复苏，以1∶100的比例接种在含氨苄青霉素的LB培养平板上，于200 r·min-1、37 ℃摇床中培养至D600 nm=0.6时，加入IPTG使其终浓度为1.0 mmol·L-1，分别在不同诱导温度(25、31、37、43 ℃)、不同诱导时间(0、2、4、6、8、10、12 h)的条件下进行诱导表达.取500 μL菌液，于8 000 r·min-1、4 ℃条件下离心5 min，收集沉淀，用100 μL PBS缓冲液洗涤沉淀，加入100 μL 1×SDS-PAGE稀释缓冲液，振荡混匀后于沸水中煮沸5 min，冰水中冷却5 min，在低温离心机中，于12 000 r·min-1、4 ℃条件下离心5 min，取上清液进行SDS-PAGE电泳检测.

1.2.5 IPTG诱导浓度的优化 在优化得到的最佳诱导温度、诱导时间条件下，分别加入0、0.2、0.4、0.6、0.8、1.0、1.2、1.5 mmol·L-1IPTG进行诱导.取500 μL菌液，于8 000 r·min-1、4 ℃条件下离心5 min，收集沉淀，用100 μL PBS缓冲液洗涤沉淀，加入100 μL 1×SDS-PAGE稀释缓冲液，振荡混匀后于沸水中煮沸5 min，冰水中冷却5 min，在低温离心机中，于12 000 r·min-1、4 ℃条件下离心5 min，取上清液进行SDS-PAGE电泳检测.

1.2.6 蛋白质印迹法鉴定 菌液在优化后的条件下进行培养，取适量提取菌体蛋白.电泳、转膜后，使用带His标签的鼠抗作为一抗，置冰箱(4 ℃)中孵育过夜.以HRP标记的羊抗鼠IgG作为二抗，于37 ℃恒温箱中孵育2 h后使用超敏ECL发光液，置化学发光成像系统中检测.

2 结果与分析

2.1 序列优化前后的对比

密码子优化前后的序列如图1、2所示.序列优化后提高了GC含量的百分比，消除不利的峰，调整密码子使用偏差以适应目标宿主基因适应度值的最高表达谱，使最终的蛋白表达效率大大增加.

2.2 重组质粒的鉴定

plnJ-K基因经PCR扩增可以得到与预期大小一致的片段，大小约为340 bp(图3A)；分别对plnJ基因(上、下游)、plnK基因(上、下游)、plnJ-K基因(上、下游)的引物进行PCR扩增，在179、179、340 bp处能看到特异性条带(图3A).对重组质粒进行双酶切鉴定，质粒在340 bp处能明显看到plnJ-K基因片段(图3B)，表明plnJ-K基因已成功连接到载体中.

2.3 最佳诱导条件的筛选

图4显示，当诱导温度为37 ℃时，诱导的菌体蛋白表达量最多.

图5显示，当诱导时间为12 h时，诱导的菌体蛋白表达量最多.

M：蛋白质分子质量标准；1～4分别为25、31、37、43 ℃.
图4 不同温度诱导的SDS-PAGE检测结果
Fig.4 Comparison on the quantity of induced protein at different temperatures by SDS-PAGE

M：蛋白质分子质量标准； 1～8分别为0、2、4、6、8、10、12、24 h.
图5 不同时间诱导的SDS-PAGE检测结果
Fig.5 Comparison on the quantity of induced protein under different durations by SDS-PAGE

图6显示，当IPTG浓度为0.6 mmol·L-1时，诱导的菌体蛋白表达量最多.

2.4 蛋白质印迹法鉴定结果

由于目前市面上没有商品化的plnJ、plnK抗体，本试验采用原核表达载体上自带的标签蛋白His的抗体进行蛋白质印迹法鉴定.图7显示，在诱导温度为37 ℃、诱导时间为12 h，IPTG浓度为0.6 mmol·L-1的条件下，通过用带His标签蛋白的抗体进行孵育，可见在48 ku处有明显的特异性条带，相对于优化前，表达量显著提高.

M：蛋白质分子质量标准；1～8分别为0、0.2、0.4、0.6、0.8、1.0、1.2、1.5 mmol·L-1.
图6 不同IPTG浓度诱导的SDS-PAGE检测结果
Fig.6 Comparison on the quantity of protein induced by different concentrations of IPTG by SDS-PAGE

M：蛋白质分子质量标准；1：优化前；2：优化后.
图7 蛋白质印迹法鉴定结果
Fig.7 Identification of the interest protein by Western-blot

3 讨论

研究表明，组成二肽类细菌素plnEF的两个二肽plnE和plnF，当它们单独作用时抑菌效果不是很显著，但这两个二肽细菌素以1∶1的摩尔浓度混合的时候，抑菌活性可以增强至少1 000倍[9].乳酸菌素虽然有较好的应用前景，但由于野生型乳酸菌分泌乳酸菌素的量极为有限，且野生型乳酸菌在生长过程中产生大量的酸，降低了培养液的酸度，抑制了乳酸菌自身的生长.现有研究表明，菌株的不同以及同一菌株在发酵中的培养时间、培养温度、培养基的pH、菌液的接种量，甚至培养基的成分，如碳源、氮源、磷酸盐等，都会影响乳酸菌素的产量.其中，培养基的成分、培养时间、培养温度对乳酸菌素产量影响的研究是最早的[10-19]，这些因素主要影响着菌株的生长及乳酸菌素的分泌.因此，探究提高乳酸菌素产量的方法对于其在实际生产中的应用具有重要的意义.本试验通过构建重组串联表达载体，探索不同温度、时间、IPTG浓度对菌体蛋白表达量的影响.结果表明：相对于其他诱导温度，37 ℃诱导菌体蛋白的表达量最多，这与杨阳等[20]的研究结果一致；相对于其他诱导时间，12 h诱导菌体蛋白的表达量最多，这与陈金峰等[21]的研究结果一致；相对于其他IPTG的诱导浓度，0.6 mmol·L-1IPTG诱导菌体的效果最佳，这与焦翠翠等[22]的研究结果一致.先前对目的蛋白表达量的研究中，目的蛋白表达量的最佳诱导条件不尽相同，这可能与菌种以及诱导条件不适合目的蛋白的表达有关[23]，其具体机制还有待进一步探索.

全长基因片段对宿主的表达负荷过大,通常会导致表达量不高等问题.本试验根据大肠杆菌密码子的偏好性，对密码子进行了优化，提高了密码子的表达量，使得其更适合在大肠杆菌BL21中表达，且目的蛋白具有更高的表达量.因此，本试验选用优化后的时间、温度、IPTG浓度诱导菌体并通过蛋白质印迹法检测菌体蛋白的表达量.相对于优化前，诱导温度为37 ℃，诱导时间为12 h，IPTG浓度为0.6 mmol·L-1时，菌体蛋白的表达量显著提高.

虽然本试验在优化密码子后，筛选了合适的诱导时间、温度、IPTG浓度能够使plnJ-K蛋白得到最大的表达量，但pln-J-K在生产实践中的应用效果还需要进一步探索.