柑橘黄龙病菌分泌蛋白的预测和原核表达

王春庆, 钟八莲, 卢占军, 黄爱军, 陈慈相,2, 苏华楠

(1.赣南师范大学生命科学学院/国家脐橙工程技术研究中心;2.赣州市果业局,江西 赣州 341000)

柑橘黄龙病(citrus Huanglongbing, HLB)是一种由革兰氏阴性细菌侵染引起的毁灭性病害[1].近年来，柑橘黄龙病蔓延严重，给柑橘产业带来了严重的经济损失[2-3].目前，该病原菌尚不能完全人工培养，且无有效治疗药剂，病树一经发现只能被砍除.我国发现的病原为韧皮部杆菌亚洲种(‘CandidatusLiberibacter asiaticus’, CLas)[4-5]，其在田间主要通过亚洲柑橘木虱(Diaphorinacitri)和嫁接传播[6].有学者通过CLas基因组揭示了该菌缺乏Ⅲ型和Ⅳ型分泌系统，但含有完整的Ⅰ型分泌系统和完善的常规蛋白分泌途径(general secretory pathway, Sec)[7]，预示着其分泌的毒力蛋白可能主要通过Sec途径进入宿主细胞.研究发现CLas效应子CLIBASIA_05315(‘C. Liberibacter asiaticus’ CLIBASIA_05315, Las5315)[8-9]也称SDE1(sec-delivered effector 1)，与木瓜蛋白酶类半胱氨酸蛋白酶(papain-like cysteine protease, PLCP)直接互作，可抑制与免疫相关的PLCPs活性，从而抑制寄主植物的免疫反应[10].

快速检测是田间病害防控的基础，血清学检测技术是不依赖核酸制备和昂贵仪器的重要检测手段，通过建立直接组织点免疫(direct tissue blot immunoassay, DTBIA)技术[11-14]和免疫胶体金快速检测试纸条[15]可大规模应用于田间病害的普查.由于柑橘黄龙病是系统侵染性病害，且病原在植株体内分布不均匀[12,16]，使用抗体靶标外膜蛋白检测易出现假阴性；而分泌蛋白可在寄主植物体内自由扩散，相对菌体在韧皮部的分布范围更广，所以使用菌体分泌蛋白作为靶标可一定程度上降低假阴性.例如：使用柑橘螺原体(Spiroplasmacitri)CAK98563分泌蛋白多抗可检测柑橘顽固病[17]；利用SDE1分泌蛋白多抗可检测柑橘黄龙病[18].然而，多克隆抗体中仅0.5%～5%的抗体可与靶标结合，且存在批次差异性，导致可重复性差，不能广泛用于病害检测和基础研究[19-20].因此，要建立稳定、准确的血清学检测方法，亟需制备特异性强、重现性好的重组抗体，如单链抗体等.

本研究通过生物信息学分析gxpsy、A4、psy62、JXGC和Ishi-1共5个已完成全基因组测序的CLas菌株，筛选共有分泌蛋白，并通过原核表达的方式纯化CLas分泌蛋白，为后续制备CLas分泌蛋白重组单抗，从而建立柑橘黄龙病高通量快速血清学检测技术体系奠定基础，同时为探索纯化的分泌蛋白功能及解析柑橘黄龙病菌的致病机理提供一定的依据.

1 材料与方法

1.1 材料

CLas分泌蛋白基因序列均来自美国国立生物技术信息中心(National Center for Biotechnology Information, NCBI)，经大肠杆菌(Escherichiacoli)密码子优化后的DNA序列由江苏南京金斯瑞生物科技有限公司合成.

E.coliXL1-Blue和BL21(DE3)感受态购自北京庄盟国际生物基因科技有限公司.载体pET-28a和pCold-I均为本实验室保存.PCR产物纯化试剂盒、质粒提取试剂盒、DNA Ligation Kit (Mighty Mix)、PrimeSTAR Max DNA Polymerase、Taq DNA聚合酶、DL2 000 DNA Marker、限制性核酸内切酶均购自TaKaRa公司.蛋白分子质量Blue Plus Ⅲ Protein Marker和Blue Plus Ⅳ Protein Marker购自北京全式金生物技术有限公司.Ni-Charged MagBeads购自江苏南京金斯瑞生物科技有限公司.基因和引物合成及测序均由江苏南京金斯瑞生物科技有限公司完成.

1.2 CLas分泌蛋白生物信息学预测分析

从NCBI数据库获取柑橘黄龙病菌gxpsy、A4、psy62、JXGC和Ishi-1菌株蛋白序列，通过SignalP[21](http://www.cbs.dtu.dk/services/SignalP-5.0/)、LipoP[22](http://www.cbs.dtu.dk/services/LipoP/)、Phobius[23](http://phobius.sbc.su.se/)和SecretomeP[24](http://www.cbs.dtu.dk/services/SecretomeP/)分别进行经典分泌蛋白(含信号肽)和非经典分泌蛋白(无信号肽)预测.去除信号肽的蛋白和非经典分泌蛋白再经TMHMM[25](http://www.cbs.dtu.dk/services/TMHMM/)预测后摒弃跨膜蛋白，最后通过MatureP[26](http://www.stepdb.eu/MatureP.php)对蛋白的分泌性进行预测，最终选定本试验原核表达所用的候选分泌蛋白.此外，通过Compute pI/Mw[27](https://web.expasy.org/compute_pi/)预测各CLas分泌蛋白的分子质量.

1.3 分泌蛋白基因密码子优化及原核表达载体构建

将候选柑橘黄龙病菌分泌蛋白基因去除信号肽序列，然后分别根据E.coliK12密码子表进行优化后，送至江苏南京金斯瑞生物科技有限公司合成，并分别通过双酶切连接至pET-28a载体，构建一系列重组表达载体pET-28a-CLasSec1～CLasSec14.未成功表达的蛋白换用pCold-I表达载体.使用SnapGene Viewer 4.3.11(https://www.snapgene.com/snapgene-viewer/)查看质粒图谱.

1.4 分泌蛋白诱导表达及条件优化

将重组载体转化至表达宿主菌BL21(DE3)，挑取单菌落于4 mL LB培养基中，37 ℃、220 r·min-1过夜培养.将菌液按1∶100的比例接种至100 mL LB培养基中，37 ℃振荡培养.当含有pET-28a-CLasSec重组表达载体的宿主菌D600 nm为0.4～0.5时，分别加入终浓度为0.5 mmol·L-1的IPTG，28 ℃过夜诱导表达；而含有pCold-I-CLasSec重组表达载体的宿主菌待D600 nm达到0.8～1.0时，迅速放入冰水中冷却30 min，然后加入终浓度为0.5 mmol·L-1的IPTG，16 ℃低温诱导24 h；未加IPTG诱导作为阴性对照.收集菌体并进行12% SDS-PAGE电泳检测.通过检测在0.05、0.1、0.2、0.4、0.5、0.6、0.8、1.0 mmol·L-1IPTG下的表达量确定各分泌蛋白的最佳诱导条件.

1.5 分泌蛋白的纯化

确定CLas分泌蛋白的最佳诱导条件后，分别对重组蛋白进行200 mL大量诱导，12 000 r·min-1离心1 min后收集菌体沉淀，用8 mL PBS缓冲液(140 mmol·L-1NaCl, 2 mmol·L-1KCl, 10 mmol·L-1Na2HPO4, 50 mmol·L-1KH2PO4, pH 8.0)进行悬浮，并进行超声破碎(冰水中超声破碎1 s，冷却3 s，总时间为30 min)，12 000 r·min-1离心3 min后将上清转移至新管，沉淀用PBS缓冲液清洗3次，然后用LE 缓冲液(100 mmol·L-1NaH2PO4, 10 mmol·L-1Tris·Cl, 8 mol·L-1尿素,pH 8.0)溶解沉淀，室温孵育30～60 min.12 000 r·min-1离心5 min后，去除不溶杂质，将上清转移至新管，经12% SDS-PAGE电泳确定目的蛋白在上清和沉淀中的表达情况后，用镍磁珠对处理好的蛋白样品进行纯化，纯化步骤参照金斯瑞Ni-Charged MagBeads说明书.

2 结果与分析

2.1 CLas分泌蛋白生物信息学预测

利用SignalP-5.0、LipoP 1.0和Phobius 3种信号肽预测工具分别对已公布的CLas完整基因组gxpsy(登录号：NC_020549.1)、A4(登录号：NZ_CP010804.1)、psy62(登录号：NC_012985.3)、JXGC(登录号：NZ_CP019958.1)和Ishi-1(登录号：NZ_AP014595.1)的蛋白序列进行分析，结果发现CLas基因组中存在大量含信号肽的经典分泌蛋白，其中，gxpsy有127个，A4有127个，psy62有121个，JXGC有124个，Ishi-1有117个.不同株系中共有的信号肽蛋白有83个(图1).

采用SecretomeP 2.0预测分析发现gxpsy非经典分泌蛋白有119个，A4有113个，psy62有116个，JXGC有111个，Ishi-1有108个，其中87个蛋白在不同株系中共存(图2).最后，经跨膜分析和分泌性预测，从中选定14个候选分泌蛋白(表1)作为检测靶标分别进行原核表达.

2.2 分泌蛋白基因密码子优化合成及原核表达载体构建

将选定的14个CLas分泌蛋白去除信号肽，根据E.coliK12密码子表优化为BL21(DE3)使用频率较高的密码子后进行基因合成，并分别克隆(包含终止密码子)连接至表达载体pET-28a，构建完成14个重组表达载体pET-28a-CLasSec1～CLasSec14，重组载体图谱如图3A所示；未成功诱导表达的分泌蛋白重新构建pCold-I-CLasSec重组载体进行诱导表达，重组载体图谱如图3B所示.

表1 14个候选CLas分泌蛋白1)Table 1 Information on 14 candidate CLas secretory proteins

1)“-”表示无信号肽或无分值.

2.3 分泌蛋白重组质粒在大肠杆菌中的诱导表达及条件优化

将重组质粒pET-28a-CLasSec1～CLasSec14转化至大肠杆菌BL21(DE3)，在28 ℃经0.5 mmol·L-1IPTG过夜诱导后进行12% SDS-PAGE电泳，考马斯亮蓝染色后发现pET-28a-CLasSec2、pET-28a-CLasSec4、pET-28a-CLasSec5和pET-28a-CLasSec8经IPTG诱导可分别产生相对分子质量为11、36、24、35 ku的His-tag融合蛋白条带(图4).此外，pET-28a载体不能诱导表达的蛋白CLasSec6和CLasSec12更换pCold-I载体后，经0.5 mmol·L-1IPTG 16 ℃诱导24 h均能成功诱导出重组目的蛋白，诱导的His-tag融合蛋白大小分别为16和13 ku(图4)，均与预期大小一致.

通过对6个分泌蛋白的诱导条件进行优化显示：pET-28a-CLasSec2、pET-28a-CLasSec4、pET-28a-CLasSec5、pET-28a-CLasSec8 28 ℃诱导的最佳IPTG浓度分别为0.5、0.2、0.8、0.6 mmol·L-1；pCold-I-CLasSec6和pCold-I-CLasSec12 16 ℃诱导的最佳IPTG浓度分别为0.05和0.6 mmol·L-1(图5).

2.4 CLas重组分泌蛋白的纯化

按照优化的最佳IPTG浓度对6个分泌蛋白分别进行诱导表达，收集菌体，超声破碎后离心，对上清液和沉淀分别进行处理，经12% SDS-PAGE电泳确定蛋白的可溶性表达情况.结果发现，重组蛋白CLasSec2-His、CLasSec4-His、CLasSec5-His和CLasSec8-His均在菌体沉淀中，表明目的蛋白为包涵体表达(图6A-C,6E).将包涵体沉淀用PBS缓冲液进行漂洗，然后用Lysis平衡缓冲液进行包涵体溶解，最后离心取上清进行镍磁珠纯化.CLasSec6-His和CLasSec12-His均在菌体裂解上清中，为可溶性表达，取其上清直接通过镍磁珠进行纯化(图6D,6F).纯化后的蛋白分别经12% SDS-PAGE电泳检测，结果显示6个蛋白均纯化获得较纯的目的蛋白(图6A-F).

3 结论

本研究借助生物信息学工具，分析了CLas 5个菌株的分泌蛋白，预测结果表明CLas含有83个经典分泌蛋白和87个非经典分泌蛋白.挑选其中14个候选分泌蛋白，分别构建了重组表达载体pET-28a-CLasSec或重组冷休克表达载体pCold-I-CLasSec，诱导并获得了纯化的分泌蛋白CLasSec2、CLasSec4、CLasSec5、CLasSec6、CLasSec8和CLasSec12.其中，CLasSec6和CLasSec12为可溶性表达，可直接制备抗体；纯化蛋白也可接种至柑橘/烟草叶片进行致病性分析.包涵体表达的分泌蛋白CLasSec2、CLasSec4、CLasSec5和CLasSec8将通过尿素变性和透析复性的方式恢复其溶解性并进行相关试验.本试验中，含有信号肽的蛋白CLasSec2、CLasSec5和CLasSec6分别对应近期已报道的CLIBASIA_00460[28]、CLIBASIA_05150[29]和SDE1[10]基因.不同效应子的发现表明柑橘黄龙病菌可能通过多个分泌蛋白共同协助病菌侵染并产生症状.有趣的是，近年来发现有些病原菌也可将无信号肽效应子分泌至胞外抑制植物的先天免疫反应[30]，因此本研究也对该类非典型分泌蛋白进行了预测整理，为后续无信号肽效应子的鉴定及其功能研究做准备.