清热化湿方对MNU 联合幽门螺杆菌感染小鼠胃组织中TNF-α、IL-8及TLR-4 水平的影响

钟 婵，张 涛，黄李冰雪，刘 畅，孙艳珍，黄晓燕，陈远能∗

（1.广西中医药大学，广西 南宁530000； 2.广西中医药大学附属瑞康医院消化内科，广西 南宁530000；3.广西医科大学第一附属医院，广西 南宁530000）

胃癌仍然是全球癌症死亡的主要原因之一，属亚洲地区分布最广［1］。胃癌的病理发生机制颇为复杂，受多因素、多基因的影响，而幽门螺杆菌已被公认为致癌的关键因子［2］，近几年已被成为研究防治胃癌的重要靶点。非可控性炎症使胃黏膜发生癌变成为必然趋势，因此探讨幽门螺杆菌感染相关胃癌中炎症介质、肿瘤坏死因子的表达情况尤为重要。以中医药理论指导为基础，前期课题组临床研究观察清热化湿方能减轻炎症反应，明显缓解幽门螺杆菌感染相关胃癌的作用反应。为进一步观察其防治胃癌的可能机制，课题组开展清热化湿方对幽门螺杆菌相关胃癌中TNF-α、IL-8 及TLR-4 表达研究。

1 材料

1.1 动物及菌株 SPF 级雄性BALB／c 小鼠90 只，购自湖南斯莱克景达实验动物有限公司，许可证号SCXK （湘）2001-0003，合格证号0060892，实验单位使用许可证编号SCXK （桂） 2010-0001。幽门螺杆菌悉尼菌株SS1 系南昌大学第一附属医院消化疾病重点实验室惠赠。大鼠组织取材于广西中医药大学实验动物中心实验室。

1.2 仪器与试剂 哥伦比亚血琼脂基础（批号CM911）、无菌脱纤维绵羊血（北京索莱宝科技有限公司）；N-甲基-N-亚硝基脲 （MNU，美国Sigma 公司，批号N136701）；Anti-TLR4 antibody （批号AB13556）、Anti-TNF-α antibody（批号AB6671），均购自英国Abcam 公司；IL-8 antibody（批号38419，美国Sab 公司）；RM2135 切片机（德国徕卡公司）；倒置光学显微镜（日本Olympus 公司）；离心机、BCA 蛋白定量试剂盒（北京华肽先锋生物科技有限公司）。

1.3 药物 清热化湿方（藿香6 g，川厚朴3 g，姜半夏4.5 g，赤茯苓9 g，杏仁9 g，生薏 苡仁12 g，白豆蔻1.8 g，猪茯苓4.5 g，淡豆豉9 g，泽泻4.5 g，黄连12 g，栀子12 g） 购自广西中医药大学第一附属医院仁爱分院。上述药材用蒸馏水煎成药液，浓缩，配制成1 g 生药／1 mL药液，过滤分装4 ℃冰箱保存。兰索拉唑肠溶胶囊（批号H20065186，扬子江药业集团有限公司，15 mg）；阿莫西林胶囊 （批 号 H44021351，珠海联 邦制药 有限公 司，250 mg）；克拉霉素（批号H20031041，江苏恒瑞医药有限公司，500 mg）。

2 方法

2.1 幽门螺杆菌培养 将幽门螺杆菌悉尼菌株SS1 系复苏后，接种于7%琼脂羊血培养基中，37 ℃细菌培养箱，在厌氧条件下培养48 h，可见菌落长出，将菌落刮下溶于布氏肉汤，制成幽门螺杆菌菌液，紫外分光光度计测浓度，幽门螺杆菌菌液为109CFU／mL。经快速尿素酶试验证实幽门螺杆菌培养成功。

2.2 模型制备 参照文献［3］ 将适应性喂养1 周的90 只健康BALB／c 小鼠，随机分成6 组，正常组、模型组、清热化湿方组（低、中、高剂量）、阳性对照组（抗幽门螺杆菌三联药）。除正常组外，剩余各组均予小鼠幽门螺杆菌菌液0.8 mL 灌胃，隔天1 次，共5 次。待幽门螺杆菌定植成功后开始进行分组干预，不同剂量清热化湿方组的小鼠分别按低、中、高（2.71、5.43、10.86 g／kg） 剂量灌胃，1 d／次，持续28 周；阳性对照组（兰索拉唑肠溶胶囊+克拉霉素+阿莫西林） 的小鼠按成人用药的6 倍给药灌胃。同时予干预组小鼠MNU 悬液 ［MNU-水 （5 mg ∶3 mL）］ 0.3 mL 灌胃，每周1 次，持续10 周；并注意观察各小鼠一般情况。末次给药后处死全部小鼠，沿胃小弯纵轴将胃组织分为两半，一半做快速尿素酶试验，另一半置于10%中性甲醛、电镜固定液中备测。

2.3 小鼠胃组织形态学改变及超微结构变化 常规HE 染色，光镜下观察炎症和癌变情况；使用醋酸铀染色，透射电镜下观察小鼠胃黏膜超微结构变化。

2.4 RT-PCR 检测胃黏膜IL-8、TLR-4 及TNF-αmRNA 表达 以β-actin为内参，检测胃黏膜IL-8、TLR-4 及TNF-αmRNA 表达，采用TRIzol 法提取RNA，然后取2 μg RNA进行逆转录得到cDNA，将逆转录的cDNA 稀释10 倍，作为模板进行PCR 检测。反应条件为95 ℃120 s～95 ℃5 s～60 ℃30 s，35～40 循环。以目的基因与内参的mRNA 表达比值作为目的基因的相对表达量。

表1 引物序列

2.5 Western blot 检测胃黏膜IL-8、TLR-4 及TNF-α 蛋白表达 以GADPH 抗体为内参，检测胃黏膜IL-8、TLR-4 及TNF-α 蛋白表达，采用凝胶成像系统扫描，以特异性条带浓度与面积的乘积为有效值，反映蛋白表达水平。具体步骤为蛋白制备，SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳，转膜、封闭、抗原抗体反应，显色、检测分析。

2.6 统计方法 用SPSS 24.0 软件进行统计学分析，计量资料用（） 表示，符合正态分布，采用方差分析；等级资料采用秩和检验。以P≤0.05 表示差异具有统计学意义。

3 结果

3.1 小鼠一般情况 造模第13 周开始，模型组部分小鼠出现精神差、食欲不振、毛发脱落、慵懒嗜睡等现象，有4 只小鼠死亡；正常组小鼠一般情况尚可；清热化湿方组、阳性对照组中各有2 只小鼠死亡。经解剖发现，模型组部分死亡的小鼠腹腔脏器有穿孔、粘连、局部黑变等现象。

3.2 光镜下各组小鼠胃黏膜组织病理学变化 图1 可见光镜下正常组无改变；小鼠胃癌造模成功率约70%，模型组癌变率占66.67%，模型组符合中分化腺癌改变；药物干预后，清热化湿方组散在溃疡改变，未见异型细胞。阳性对照组炎性细胞浸润，符合溃疡改变，可见少许异型细胞。

3.3 吉姆萨染色检测各组小鼠幽门螺杆菌感染情况 图2可见正常组无幽门螺杆菌感染；模型组、阳性对照组、清热化湿方组胃黏膜细胞核呈蓝色或紫色，胞浆呈粉红色，幽门螺杆菌呈平滑的淡蓝色至蓝色，弯曲状或弧形，菌体清楚，主要分布在胃黏膜及胃小凹表面，呈单个散在、片灶状或成团聚集，组织背景清晰，胃黏膜病变易见。提示模型组、阳性对照组、清热化湿方组幽门螺杆菌定植成功。

3.4 各组电镜下小鼠胃黏膜超微结构变化 图3 可知正常组无明显改变；模型组细胞间隙连接结构严重破坏，癌细胞散在于间质中；清热化湿组细胞间隙连接结构破坏，分化较差的上皮细胞和肠化生细胞核质比大于1，见少许凋亡小体。阳性对照组细胞间隙连接结构破坏，分化较差，见少许凋亡小体。

图1 光镜下各组小鼠胃黏膜组织病理学变化

图2 吉姆萨染色检测各组小鼠幽门螺杆菌感染情况（×40）

3.5 各组小鼠胃黏膜IL-8、TLR-4、TNF-α 蛋白表达 与正常组比较，模型组IL-8、TLR-4、TNF-α 表达上升，差异有统计学意义（P＜0.05）；与模型组比较，清热化湿方组IL-8、TLR-4、TNF-α 表达下降，差异有统计学意义（P＜0.05）。

3.6 各组小 鼠胃黏 膜IL-8、TLR-4、TNF-α mRNA 表达 与正常组比较，模型组IL-8、TLR-4、TNF-α 表达上升，差异有统计学意义（P＜0.05）；与模型组比较，清热化湿方组IL-8、TLR-4、TNF-α 表达下降，差异有统计学意义（P＜0.05）。见图5。

4 讨论

以中医理念探讨胃癌病机，祖国医学认为，饮食不节，情志失调，脾胃受损，运化升降失常，使气结痰凝，瘀停热蕴，气、痰、瘀、毒互结胃腑而成。中医胃癌治则始终以保护脾胃正气，推动其运化生气血，条达升降之职。课题组以清热化湿、健脾和胃的治则，选择清热化湿方探讨该方防治胃癌的相关机制；方中淡豆豉、藿香芳香透表湿，开郁阳气；藿香、白蔻仁、厚朴芳香化湿，佐半夏行运脾化湿之功；杏仁开泄肺气于上焦，肺气宣降，水道自调，而治湿宜利小便，水道通调，则湿有去路，故茯苓、猪苓、泽泻、薏苡仁相伍通渗下焦。黄连擅清中焦湿热之邪，栀子清三焦之火。诸药合用，宣化表里湿热，通调上、中、下三焦，奏清热化湿、健脾和胃功效［4-7］。

图3 各组小鼠电镜下胃黏膜超微结构变化（×12 000）

图4 各组小鼠胃黏膜IL-8、TLR-4、TNF-α 蛋白表达

图5 各组小鼠胃黏膜IL-8、 TLR-4、 TNF-α mRNA 表达

研究报道，幽门螺杆菌感染参与了胃癌的演变过程［8］，幽门螺杆菌可刺激胃上皮细胞产生炎症因子，如IL-8、TNF-α 等，而幽门螺杆菌要启动炎症因子必须借助TLR-4 受体，该受体参与识别细菌细胞壁中的脂多糖（LPS），几乎所有的TLRs 都能激活MyD88 依赖性的通路而诱发炎症反应，而有相关报道说明，在MiR-155 的多个靶点中，MyD88 被认为是IL-8 调控的靶点，MiR-155 可能通过抑制翻译而下调蛋白MyD88 的表达进而降低IL-8 的产生［9-10］。经研究表明，幽门螺杆菌感染可促进IL-8 在胃黏膜中过度表达，且IL-8 的高表达与胃癌预后不良呈直接相关［11］。相关研究表明IL-8 rs4073 多态性可能作为亚洲人胃癌的遗传生物标记物［12］。相关Meta 分析表明，TNF-α基因多态性与胃癌风险有关，尤其是对亚洲人而言［13］。据研究表明，TNF-α-85 7C／T、IL-8-845 T／C 功能多态性均可明显增加胃癌或慢性胃炎的发生风险，还观察到多态性C 等位基因携带者的IL-8 基因表达水平显著增高［14］。研究发现，TLR-4 中的rs4986790 和rs4986791 多态性可以作为预测幽门螺杆菌诱发胃癌风险的遗传标记［15］。这进一步阐明IL-8、TLR-4、TNF-α 均参与诱导炎症免疫，且在胃癌的进展中起重要作用。由此说明，由慢性胃炎发展至胃癌过程中，必须在幽门螺杆菌感染基础上通过介导TLR-4 信号通路激活下游靶基因MyD88，使AP-1 转录因子产生核易位进而调节IL-8，此时TNF-α 也加速了炎症反应进程。本研究发现，清热化湿方干预MNU 联合幽门螺杆菌感染小鼠后，其胃黏膜组织IL-8、TNF-α 及TLR-4 蛋白和mRNA 表达均呈下降趋势，提示清热化湿类方药可以调控IL-8、TNF-α、TLR-4 表达，发挥防治胃癌的效应。基于本实验结果，下一步可以从胃癌的靶向分子治疗角度，筛选出与TLR-4 信号通路密切相关靶基因，拟采用分子生物技术调控该靶基因下游相关蛋白，并检测相关指标表达。同时结合清热化湿方药进行干预，进一步揭示清热化湿类方药干预胃癌的作用机理与有效靶点，开拓中医药防治胃癌的新领域。