莪术醇固体脂质纳米粒的制备及其抗肿瘤活性

王风云，李伟宏

（河南应用技术职业学院，河南 郑州450042）

莪术是姜科植物蓬莪术、温郁金或广西莪术的根茎［1］，莪术油是其主要提取物，具有较强的抗肿瘤、抗病毒、抗炎等作用［2-3］。莪术醇是莪术特征性成分，对乳腺癌、卵巢癌、结肠癌、白血病、骨肉瘤等均具有抑制效果［4-6］，但药效不高［7-8］。另外，莪术醇注射液中含有高浓度的增溶剂吐温-80，临床应用时易引起溶血、过敏、疼痛等不良反应［7］。

固体脂质纳米粒［9-14］是采用与人体生物相容性较好的脂质材料制成的一种新型给药系统，注射后可显著增强药物疗效。本实验制备莪术醇固体脂质纳米粒，并对其粒径、Zeta 电位、形态、体外释药、光降解等情况进行考察，MTT 法评价其对人宫颈癌上皮细胞（Caski 细胞） 的抑制作用，以期为进一步相关研究奠定基础。

1 材料

Agilent 1100 型高效液相色谱仪（美国Agilent公司）；JY92-Ⅲ型超声仪（浙江大天科学仪器有限公司）；QUINTX224-1CM 型电子天平 （德国Sartorius公司）；Zano-ZS90 型粒度分析仪（英国马尔文仪器公司）；H-800 型透射电子显微镜（日本Hitachi 公司）；SZCL-H 型温控磁力搅拌器（郑州宇华仪器有限公司）；Kylin-Bell 型漩涡混合器（海门其林贝尔仪器制造有限公司）；FD10-QX 型真空冻干机（上海天赐科学仪器公司）；JXDC-400型氮气吹扫仪（拓赫机电科技上海有限公司）；HNA-122DTABA I 型CO2恒温培养箱（日本三洋公司）；MR-96T 型酶标仪（南京贝登医疗股份有限公司）。

莪术醇对照品 （批号100185-201507，纯度99.9%，中国食品药品检定研究院）；莪术醇（批号Y-088-171005，纯度98.8%，上海源叶生物科技有限公司）；单硬脂酸甘油酯（批号T160522，德国巴斯夫有限公司）；大豆卵磷脂（批号PC-98T，上海辅必成医药科技有限公司）；泊洛沙姆188（批号WPW1602B，德国巴斯夫公司）；胎牛血清（FBS）、RPMI-1640 培养基 （美国Gibco 公司）；胰蛋白酶（美国Hyclone 公司）；四甲基偶氮唑盐（MTT，批号1524B37）、二甲基亚砜 （DMSO）（美国Amresco 公司）。

人宫颈癌上皮细胞（Caski 细胞，上海研域生物工程有限公司）。

2 方法与结果

2.1 莪术醇固体脂质纳米粒制备 采用乳化超声分散法（避光操作）。称取20 mg 莪术醇、80 mg大豆磷脂、300 mg 单硬脂酸甘油酯，溶于10 mL温度为（60±1） ℃的无水乙醇中，作为有机相；另取0.2 g 泊洛沙姆188，溶于30 mL 温度为（60±1） ℃的蒸馏水中，作为水 相。在转速1 000 r／min条件下，将有机相逐滴加入水相中，继续搅拌3 h，得到初乳（体积约15 mL），将其置于超声波细胞粉碎仪中超声处理8 min （功率600 W，每超声3 s 间隔2 s） 后立即放到-20 ℃冰箱中固化，蒸馏水定容至30 mL，即得。

2.2 莪术醇含有量测定

2.2.1 色谱条件 Hypersil ODS-C18色谱柱（250 mm×4.6 mm，5 μm）；流动相乙腈-水（40 ∶60）；体积流量1.0 mL／min；柱温35 ℃；检测波长215 nm；进样量20 μL。

2.2.2 线性关系考察 称取10.20 mg 莪术醇对照品于100 mL 量瓶中（避光操作），加入70 mL 甲醇超声溶解，静置30 min 后甲醇定容至刻度，得到102 μg／mL 贮备液，放到冰箱中保存，流动相逐步稀释成 5.1、10.2、25.5、51.0、102.0 μg／mL，在“2.2.1” 项色谱条件下进样测定。以溶液质量浓度为横坐标（X），峰面积为纵坐标 （Y） 进行回归，得方程为Y＝1.414 6X-0.063 8 （r＝0.999 5），在5.1～102.0 μg／mL范围内线性关系良好。

2.2.3 供试品、空白溶液制备 精密称取莪术醇固体脂质纳米粒混悬液0.5 mL 于10 mL 量瓶中（避光操作），加入5 mL 乙腈超声提取3 min，静 置 30 min 后甲醇 定容至刻度，15 000 r／min离心15 min，取上清液，即得。同法制备空白溶液。

2.2.4 方法学考察分别取 102.0、51.0、5.1 μg／mL “2.2.2” 项下对照品溶液作为高、中、低质量浓度，在“2.2.1” 项色谱条件下进样测定6 次，测得莪术醇峰面积RSD 分别为0.18%、0.13%、0.43%，表明仪 器精密 度良好。取“2.2.3” 项下供试品溶液，于0、2、4、8、12、24 h，在“2.2.1” 项色谱条件下进样测定，测得莪术醇峰面积RSD 为0.84%，表明溶液在24 h 内稳定性良好。按“2.2.3” 项下方法平行制备6 份供试品溶液，在“2.2.1” 项色谱条件下进样测定，测得莪术醇峰面积RSD 为1.46%，表明该方法重复性良好。取6.5 mL 102.0 μg／mL对照品溶液于10 mL 量瓶中，甲醇定容至刻度（66.3 μg／mL），取0.8、1.0、1.2 mL于0.5 mL 空白固体脂质纳米粒混悬液中，各平行3 份，按“2.2.3” 项下方法制备供试品溶液，在“2.2.1” 项色谱条件下进样测定，测得莪术醇平均加样回收率分别为99.01%、100.23%、99.87%，RSD 分别为1.14%、0.69%、1.38%。以上实验均避光操作。

2.3 包封率、载药量测定 采用超滤离心法。量取2.0 mL 莪术醇固体脂质纳米粒混悬液于超滤离心管 中 （截留分子量 8 000～12 000 Da），15 000 r／min 离心60 min，取滤液，在 “2.2.1”项色谱条件下进样测定，计算莪术醇含有量（m游离）；量取0.5 mL 纳米粒混悬液于10 mL 量瓶中，加入5 mL 乙腈超声3 min，静置30 min 后甲醇定容，15 000 r／min 离心15 min，在“2.2.1”项色谱条件下进样测定，计算莪术醇含有量（m总），再测定包封率、载药量，公式分别为包封率＝ ［（m总-m游离） ／m总］ × 100%，载药量＝［（m总-m游离） ／m总质］ ×100%，其中m总质表示莪术醇固体脂质纳米粒总质量，平行3 次，取平均值。结果，平均包封率为83.27%，载药量为3.83%。

2.4 粒径分布、Zeta 电位测定 平行制备3 批莪术醇固体脂质纳米粒混悬液，取0.2 mL 与4.0 mL蒸馏水混匀，取3.5 mL 进行测定，结果见图1～2。由此可知，平均粒径为（198.84±4.17） nm，PDI为0.151±0.013，Zeta 电位为（-21.8±2.5） mV。

图1 莪术醇固体脂质纳米粒粒径分布Fig.1 Particle size distribution of curcumolloaded solid lipid nanoparticles

图2 莪术醇固体脂质纳米粒Zeta 电位Fig.2 Zeta potential of curcumol-loaded solid lipid nanoparticles

2.5 形态观察 取100 μL 莪术醇固体脂质纳米粒，加入900 μL 蒸馏水，滴加到有支持膜的铜网上，均匀铺展后静置15 min，滤纸吸干，放到5%磷钨酸溶液中浸泡8 min 染色，自然晾干，在透射电镜（TEM） 下观察形态，选定区域后拍摄电镜照片，结果见图3。由此可知，所制备的莪术醇固体脂质纳米粒呈类球形或球形，大小均匀，未见粘连现象。

图3 莪术醇固体脂质纳米粒TEM 图Fig.3 TEM image for curcumol-loaded solid lipid nanoparticles

2.6 体外释药研究

2.6.1 线性关系考察 取“2.2.2” 项下对照品贮备液，精密量取2.0 mL 于10 mL 量瓶中，流动相定容至刻度（20.4 μg／mL），流动相逐步稀释成10.2、5.1、0.51、0.051 μg／mL 的对照品溶液，在“2.2.1” 项色谱条件下进样测定。以溶液质量浓度为横坐标（X），峰面积为纵坐标（Y） 进行回归，得方程为Y＝1.607 5X-0.078 1 （r＝0.999 7），在0.051～20.4 μg／mL 范围内线性关系良好。

2.6.2 方法学考察 分别取“2.6.1” 项下20.4、5.1、0.051 μg／mL 对照品溶液作为高、中、低质量浓度，在“2.2.1” 项色谱条件下进样测定6次，测得莪术醇峰面积RSD 分别为0.62%、1.15%、1.38%，表明仪器精密度良好。取5 mL莪术醇固体脂质纳米粒混悬液（0.64 mg／mL），置于活化的透析袋中 （截留分子量 8 000～14 000 Da），两端扎紧，溶出介质无250 mL 脱气蒸馏水，设置溶出仪温度为（37±1）℃，转速为100 r／min，6 h 时取样2 mL，滤过，取续滤液，作为供试品溶液，分别于0、2、8、12、24、36 h，在“2.2.1” 项色谱条件下进样测定，测得莪术醇峰面积RSD 为1.63%，表明溶液在36 h 内稳定性良好。取0.8、1.0、1.2 mL 5.1 μg／mL 对照品溶液，加到1.0 mL 供试品溶液中，各平行3 份，滤过，在“2.2.1” 项色谱条件下进样测定，测得平均加样回收率分别为 99.12%、100.86%、99.05%，RSD 分别为1.71%、1.09%、1.53%。

2.6.3 体外溶出实验 取5 mL 莪术醇固体脂质纳米粒混悬液（0.64 mg／mL） 和3.2 mg 莪术醇原料药（加入5 mL 乙醇），置于活化的透析袋中（截留分子量8 000～14 000 Da），两端扎紧（避光操作），溶出介质为250 mL 脱气蒸馏水，设置溶出仪温度为（37±1）℃，转速为100 r／min，于0、0.5、0.75、1、1.5、2、4、6、8、12、24、36 h各取样2 mL，并立即补加2 mL 脱气蒸馏水，在“2.2.1” 项色谱条件下进样测定，计算累积释放度，绘制释药曲线，结果见图4，可知莪术醇在4 h内几乎全部溶出，而其固体脂质纳米粒在体外具有明显缓释特征，36 h 内累积溶出度为61.81%；体外释药拟合结果见表1，可知它更符合Weibull 模型（R2＝0.960 5）。

图4 莪术醇、莪术醇固体脂质纳米粒体外释药曲线Fig.4 In vitro drug release curves for curcumol and curcumol-loaded solid lipid nanoparticles

表1 体外释药拟合结果Tab.1 Results of in vitro drug release fitting

2.7 光稳定性评价 分别配制6 份50 mL 莪术醇溶液及其固体脂质纳米粒混悬液，置于透明锥形瓶中，质量浓 度均为 0.2 mg／mL 于日光 灯（4 500 lx，25 ℃） 下照射，于0、2、4、8、12、24 h 各精密取样1 mL，置于5 mL 量瓶中，甲醇定容，在“2.2.1” 项色谱条件下进样测定，结果见表2，可知固体脂质纳米粒可显著提高莪术醇光稳定性。

表2 莪术醇光稳定性试验结果Tab.2 Results of light stability tests for curcumol

2.8 抗肿瘤活性研究

2.8.1 给药液制备 10.0 mg 莪术醇用50 mL DMSO 溶解，得到200 μg／mL 母液，临用前用含10% FBS 的RPMI-1640 培养液 稀释成25、50、100、150 μg／mL；取适量莪术醇固体脂质纳米粒混悬液（莪术醇含有量为0.64 mg／mL），临用前用含10% FBS 的RPMI-1640 培养液稀释成25、50、100、150 μg／mL，即得。

2.8.2 细胞培养 Caski 细胞于RPMI1640 培养基中培养（含10% 胎牛血清、100 μg／mL 链霉素、100 U／mL 青霉素），并置于温度37 ℃、5% CO2、饱和湿度培养箱中。

2.8.3 实验方法 取对数生长期的Caski 细胞，0.25%胰蛋白酶消化后轻轻吹打成单细胞悬液，用含10% FBS 的RPMI1640 培养液调整细胞浓度至5×104／mL，接种于96 孔板中，每孔100 μL，置于温度37 ℃、5%CO2、饱和湿度培养箱中培养24 h，待细胞贴壁后弃去培养液。设置空白溶剂组（培养液）、溶剂对照组（培养液+细胞）、莪术醇组、莪术醇固体脂质纳米粒组，每个质量浓度设置3 个复孔，培养24、48、72 h 后取出96 孔板，每孔加入20 μL 5 mg／mL MTT 溶液，于37 下℃继续孵育4 h，甩板后弃去残留液体，每孔加入150 μL DMSO，置于摇床上振荡0.5 h 充分溶解蓝紫色结晶，酶标仪在490 nm 波长处测定吸光度（A），计算细胞生长抑制率，公式为抑制率＝ ［1 -（A给药-A空白溶剂） ／ （A空白对照-A空白溶剂）］ ×100%。

2.8.4 增殖抑制率测定 表3 显示，不同质量浓度莪术醇溶液及莪术醇固体脂质纳米粒混悬液作用一段时间后，Caski 细胞生长均受到抑制，随着用药量升高而更明显，并且在用药量相同的条件下作用时间延长时亦然，即呈明显的量效和时效关系。另外，在相同用药量的条件下莪术醇固体脂质纳米粒的抑制效果均高于莪术醇，作用48、72 h 后更明显（P＜0.05，P＜0.01）。

表3 Caski 细胞抑制率测定结果（， n＝3）Tab.3 Results of inhibitory rate determination of Caski cells （， n＝3）

表3 Caski 细胞抑制率测定结果（， n＝3）Tab.3 Results of inhibitory rate determination of Caski cells （， n＝3）

注：与莪术醇比较，∗P＜0.05，∗∗P＜0.01。

3 讨论

纳米给药系统已成为药剂学研究热点之一［15-16］，应用于抗肿瘤药物给药时体现出巨大的优势［14］。本实验制备的莪术醇固体脂质纳米粒采用混合脂质材料作为药物载体，包封率达83.27%。可能是混合脂质载体可增加晶格混乱程度，使更多药物被包裹进入纳米粒［17-18］。

体外抗肿瘤实验结果显示，莪术醇及其固体脂质纳米粒对Caski 细胞生长的抑制具有时效和量效关系，以后者抑制效果更强，可能与纳米粒增强莪术醇光稳定性有关［19］，一方面固体脂质纳米粒对光的散射作用降低了莪术醇与光的接触几率；另一方面，固体脂质纳米粒对莪术醇包裹后降低了外部环境对其影响，从而提高了稳定性。

体外释药实验结果显示，莪术醇固体脂质纳米粒具有明显的缓释特征［20］，与体外抗肿瘤实验结果一致，可能是因为载药纳米粒高效扩散进入细胞后可持续、缓慢地释放药物，从而有效抑制Caski肿瘤细胞生长。

对莪术油新剂型的研究较多，但由于它是一种混合物，不仅影响了制剂含药量，也容易导致制剂稳定性较差、产生毒性的问题［21］，故将有明确疗效的单体（如莪术醇等） 进行新制剂研究具有较大意义。今后，将把研究重点放在莪术醇固体脂质纳米粒冻干粉末的制备、表面修饰、作用机制［22］、体内药动学及抑瘤效果上，为相关制剂研发及临床应用提供资料。