四神丸中3 种成分在正常大鼠及抑郁大鼠体内药动学的比较

孙 红，宋珊珊，井 汶，张 优，谷 雨，居文政

（南京中医药大学附属医院，江苏 南京210029）

抑郁症具有高发病、高自杀、高复发和低识别、低就诊、低治疗等特点，已成为21 世纪最主要的精神疾病，据WHO 统计，全球抑郁症患者达12.8%，预计2030 年将成为仅次于心血管疾病的第二大疾病［1-2］，我国患病率高达6.1%［3］。目前，抗抑郁西药以单胺类抑制剂为主［4］，但这些药物起效慢，不良反应明显，而且30%～50%的患者不敏感。近年来，中医药在防治抑郁症上获得较好的临床疗效。

四神丸出自 《证治准绳》，由肉豆蔻、补骨脂、五味子、吴茱萸、大枣等药材组成［5］，具有温补脾肾的功能，组方加减后用于治疗脾肾阳虚患者有一定疗效［6］。原发性抑郁、内源性抑郁、恶劣心境中的抑郁情绪在本质上“属虚”，五脏阳气不足是其病理基础［7］，根据中医郁证病机中“阳虚致郁” 的理论［8-9］，四神丸可改善脾肾阳虚所致的抑郁状态，动物实验表明［10-14］，方中补骨脂和五味子中主要成分补骨脂素、异补骨脂素、五味子醇甲具有抗抑郁作用，但作用机理尚不明确，虽然已有方中补骨脂素、异补骨脂素在正常大鼠中的药动学研究［15］，但尚未见在抑郁大鼠中的相关报道。因此，本实验将比较四神丸中上述3 种成分在正常大鼠和抑郁大鼠体内的药动学，探索其作用机理。

1 材料

1.1 仪器 Agilent 1200 高效液相色谱仪，配置API 4000 LC-MS／MS 三重四级杆质谱仪 （美国Agilent 公 司）；MS105 电子天 平 （瑞 士Mettler-Toledo 公司）；Centrifuge-5417R 冷冻离心机（德国Eppendorf 公司）；Advantage A10 超纯水机（法国Millipore 公司）；MIX-25P 旋涡混合仪（杭州米欧仪器有限公司）；Labconco 离心浓缩仪 （美国Labconco 公司）；RE-52CS 旋转蒸发仪（上海亚荣生化仪器厂）。

1.2 试剂与药物 肉豆蔻（煨） （批号171001）、补骨脂（盐炒） （批号180404006）、五味子（醋制） （批号170513001）、吴茱萸（制） （批号160623）、大枣（去核） （批号170520001） 均购于北京同仁堂南京药店，经江苏省中医院药学部副主任中药师张倩鉴定为正品，符合《中国药典》标准。对照品补骨脂素（批号17092820）、异补骨脂素 （批 号18062910）、五味子醇甲 （批 号17021905） 均购于成都曼思特生物科技有限公司，纯度均≥98.5%；替硝唑 （批号100126-200402）购于中国食品药品检定研究院，纯度≥95%。四神丸根据2015 年版《中国药典》 处方自制，补骨脂、肉豆蔻、五味子、吴茱萸、大枣比例为4 ∶2 ∶2 ∶1 ∶2，上述药材用10 倍量75% 乙醇浸泡30 min，回流提取2 h，滤渣再加8 倍量75%乙醇回流提取1 h，合并滤液，减压浓缩至无醇味，-20 ℃下保存，1 100 g 药材浓缩至785 mL，即每1 mL 药液含1.4 g 原药材（分别含补骨脂素、异补骨脂素、五味子醇甲1.60、1.36、0.65 mg）。甲醇、乙腈购自德国Merck 公司；水为超纯水。

1.3 动物 SD 大鼠，雄性，12 只，体质量（190±10）g，由南通大学实验动物中心提供，动物生产许可证号SCXK （苏） 2019-0001。实验前大鼠适应性饲养1 周，保持12 h 昼夜节律，室温（22±2） ℃，自由摄食饮水。

2 方法与结果

2.1 色谱、质谱条件 ACE Excel 3 C18-PFP 色谱柱（100 mm×3.0 mm）；流动相乙腈-0.1% 甲酸（36 ∶64）；体积流量500 μL／min；柱温40 ℃；离子源ESI+，多反应检测模式（MRM）；离子源电压4 000 V；离子源温度400 ℃。质谱参数见表1。

表1 各成分质谱参数Tab.1 MS parameters for various constituents

2.2 溶液制备 精密称取补骨脂素、异补骨脂素、五味子醇甲对照品适量，甲醇分别溶解定容至2.07、2.14、2.00 mg／mL，以此为母液，临用前稀释。再精密称取替硝唑适量，配制成100 ng／mL内标液。

2.3 血浆样品处理 取100 μL 空白血浆，加入10 μL 内标溶液，涡旋混匀30 s，加入800 μL 乙酸乙酯，振荡3 min，12 000 r／min 离心10 min，取700 μL 上清液，40 ℃下离心浓缩，加入100 μL 50%乙腈复溶，振荡3 min，12 000 r／min 离心10 min，取5 μL 上清液进样分析。

2.4 造模及血浆样品采集 大鼠按体质量均衡和随机的原则分为正常组和模型组，每组6 只，正常组每笼3 只，模型组单笼饲养，并在21 d 内接受10 种刺激因子，包括禁食、禁水、潮湿垫料、昼夜颠倒、闪光、4 ℃冰水游泳、热刺激5 min、束缚应激6 h、水平振荡10 min、触摸陌生异常物品。确认造模成功后，第22 天大鼠禁食不禁水12 h，灌胃给 予四神 丸混悬 液 6.48 g／kg （即4.63 mL／kg），于给药前及给药后5、15、30、45、60、90、120、180、240、360、480、720、960、1 440 min眼眶取血各约0.3 mL，置于肝素化EP 管中，4 000 r／min 离心10 min，取上层血浆保存于-80 ℃冰箱中待测。

2.5 行为学实验 在造模3 周后开始。

2.5.1 糖水消耗实验 大鼠在适应性期间给予2瓶2%蔗糖溶液适应3 d 后，才进行实验。大鼠禁水18 h，每只给予体积相同的1 瓶2%蔗糖溶液和1 瓶纯水，测试4 h，其中每2 h 2 瓶水交换位置。实验结束后，计算糖水消耗率，公式为糖水消耗率＝ ［（蔗糖消耗量） ／ （纯水消耗量+蔗糖消耗量）］ ×100%。

2.5.2 旷场实验 实验前需提前将大鼠搬入测试室使其适应环境1 h，再放入长、宽、高均为50 cm，内壁涂黑的纸箱中心，底面平均分为25个10 cm×10 cm 的小方格。以5 min 内大鼠三爪以上穿越底面的方格数为水平得分，穿越1 格得1 分；以大鼠双前肢抬起1 cm 以上次数为垂直得分，离地一次得1 分。实验过程进行摄像和计时。

2.5.3 强迫游泳实验 正式实验前1 d 大鼠进行预游泳，将其放入（24±2）℃水中并保持悬浮，四肢不能触及桶底，15 min 后取出，擦干放回笼中，整个实验过程保持安静。次日在相同条件下大鼠强迫游泳5 min，记录后4 min 内不动时间（大鼠仅有头部露出水面，呈漂浮状态，四肢可有微动）。

2.5.4 结果分析 经过21 d 造模后，与正常组比较，模型组大鼠糖水消耗率、水平得分、竖直得分降低 （P＜0.05，P＜0.01），不动时 间延长（P＜0.05），显示造模成功，见表2。

表2 各组大鼠行为学实验结果（， n＝6）Tab.2 Results of behavioral tests for rats in various groups （， n＝6）

表2 各组大鼠行为学实验结果（， n＝6）Tab.2 Results of behavioral tests for rats in various groups （， n＝6）

注：与正常组比较，∗P＜0.05，∗∗P＜0.01。

2.6 方法学考察

2.6.1 专属性考察 取空白大鼠血浆、空白大鼠血浆+对照品+内标（替硝唑）、给药1 h 后血浆样品，按“2.3” 项下方法处理，在“2.1” 项条件下进样测定，结果见图1。由此可知，补骨脂素、异补骨脂素、五味子醇甲、内标（替硝唑） 保留时间分别为4.72、5.24、7.34、1.5 min，各成分与内标色谱峰峰形良好而且互不干扰，同时血浆中杂峰也无干扰，基线平稳，表明该方法专属性良好。

图1 各成分LC-MS／MS 色谱图Fig.1 LC-MS／MS chromatograms of various constituents

2.6.2 线性关系考察 取100 μL 空白大鼠血浆，加入对照品、内标溶液各10 μL，按“2.3” 项下方法处理，在“2.1” 项条件下进样测定。以各成分峰面积与内标峰面积的比值为纵坐标（Y），溶液质量浓度为横坐标（X） 进行回归，以S／N≥10为最低定量限，结果见表3，可知各成分在各组范围内线性关系良好。

表3 各成分线性关系Tab.3 Linear relationships of various constituents

2.6.3 准确度、精密度试验 取100 μL 空白大鼠血浆，制成低、中、高3 个质量浓度的样品（补骨脂素3.2、80、1 200 ng／mL，异补骨脂素1.6、40、600 ng／mL，五味子醇甲0.32、8、120 ng／mL），按“2.3” 项下方法处理，在“2.1” 项色谱条件下进样测定，连续3 d，结果见表4，可知该方法准确度、精密度良好。

表4 各成分准确度、精密度、基质效应试验结果Tab.4 Results of accuracy，precision and matrix effect tests for various constituents

2.6.4 基质效应试验 精密加入低、中、高质量浓度对照品溶液及内标溶液各10 μL，复溶到80 μL，振荡3 min，12 000 r／min 离心10 min，取上清液5 μL，在“2.1” 项色谱条件下进样测定，峰面积为A1；按“2.3” 项下方法提取空白血浆（不加内标），离心浓缩后同法操作，峰面积为A2，计算基质效应，公式为基质效应＝A2／A1×100%，结果见表4，可知内源性物质对3 种成分无影响。

2.6.5 稳定性试验 取100 μL 空白大鼠血浆，按“2.6.3” 项下方法制成低、中、高3 个质量浓度的样品各3 份，分别在室温下放置12 h、-20 ℃下反复冻融3 次、-80 ℃下保存30 d 后，在“2.1”项色谱条件下进样测定。结果，补骨脂素、异补骨脂素、五味子醇甲峰面积RSD 分别为0.99%～5.16%、1.09%～4.78%、0.90%～4.24%，表明该方法稳定性良好，符合生物样品分析要求。

2.6.6 提取回收率 取100 μL 空白大鼠血浆，按“2.6.3” 项下方法制成低、中、高3 个质量浓度的质控样品，各5 份，在“2.1” 项色谱条件下进样测定，峰面积为A3，计算提取回收率，公式为提取回收率＝A3／A2×100%。结果，补骨脂素、异补骨脂素、五味子醇甲提取回收率分别为66.33%～70.28%、61.28%～74.45%、61.93%～68.16%。

2.7 药动学研究 各成分在正常大鼠、抑郁大鼠体内的血药浓度-时间曲线见图2，经DAS1.0 软件处理分析后主要药动学参数见表5。由此可知，各成分药动学均符合一室模型；与正常组比较，模型组各成分Cmax、AUC0～t升高（P＜0.05，P＜0.01），以异补骨脂素更明显。

图2 各成分血药浓度-时间曲线Fig.2 Plasma concentration-time curves for various constituents

表5 各成分主要药动学参数（， n＝6）Tab.5 Main pharmacokinetic parameters for vairous constituents （， n＝6）

表5 各成分主要药动学参数（， n＝6）Tab.5 Main pharmacokinetic parameters for vairous constituents （， n＝6）

注：与正常组比较，∗P＜0.05，∗∗P＜0.01。

3 讨论

本实验在测定大鼠血浆中补骨脂素、异补骨脂素、五味子醇甲含有量时发现，补骨脂素、异补骨脂素是同分异构体，质荷比相同，质谱无法区分，故应用液相色谱将两者分离开。在考察流动相时发现，乙腈作为有机相峰形和出峰时间较好，而0.1%甲酸作为水相同分异构体峰形良好。再通过考察不同型号和品牌色谱柱，确定ACE Excel 3 C18-PFP色谱柱（100 mm×3.0 mm） 能满足分析要求。

在血浆样本处理过程中，本实验考察了蛋白沉淀（甲醇、乙腈、10% 三氯乙酸） 和液液萃取（乙酸乙酯、丙酮、二氯甲烷），发现甲醇、乙腈蛋白沉淀的提取回收率与乙酸乙酯萃取的相近，且后者萃取后能明显减少血浆样本内源性物质干扰，提高基质效应，故选择乙酸乙酯萃取作为前处理方法。

不同文献报道的补骨脂素、异补骨脂素药动学参数并不一致［15］，其原因可能是本实验采用75%乙醇作为提取溶剂，而文献采用水煎煮法，提取出来成分相差较大，给药剂量也有所差异。与正常组大鼠比较，模型组补骨脂素、异补骨脂素、五味子醇甲t1／2无明显差异；异补骨脂素、五味子醇甲Tmax无明显差异，而补骨脂素Tmax高于正常组；3种成分在抑郁大鼠体内的Cmax分别为在正常大鼠体内的1.36、1.30、1.47 倍，AUC0～t分别为1.38、1.27、1.40 倍，AUC0～∞分别为1.38、1.26、1.33倍，表明各成分吸收程度在抑郁大鼠体内明显提高，而消除速度无明显变化，其原因可能是疾病状态导致其吸收过程发生改变［16-17］。综上所述，大鼠在抑郁状态下四神丸中补骨脂素、异补骨脂素、五味子醇甲血药浓度明显改变，对临床上抑郁症患者用药量具有一定参考意义。