鱼鳔质量标准的提升

段秀俊，刘 培，杨 超，孙铭忆，何娟娟，范姣姣，段青青

（山西中医药大学，山西 晋中030619）

鱼鳔又名鱼白、鱼脬、鱼肚，为石首鱼科动物大黄鱼Pseudosciaena crocea（Richardson）、小黄鱼Pseudosciaena polyactisBleeker，或鲟科动物中华鲟Acipenser sinensisGray、鳇鱼Huso dauricus（Georgi）等鱼鳔［1-2］，其药用始载于《本草拾遗》［3］，性平味甘，归肾经，具有补肾益精、滋养筋脉、止血、散瘀、消肿之功效，用于肾虚滑精、产后风痉、破伤风、吐血、血崩、创伤出血、痔疮等［2］。它不仅是一味具有滋补作用的中药，而且食用历史悠久，《齐民要术》 中就有加工食用石首鱼鳔（黄花鱼一类） 的记载，唐代已被列为贡品，明代开始在民间普遍食用［4］，其富有胶质，与燕窝、鱼翅齐名，为 “ 海洋八 珍” 之 一，誉 之 “ 海 洋人参”［5］。

目前，鱼鳔被山西、山东、湖南等地药材标准所收载，但缺少显微鉴别及基于色谱分析的含有量测定［2，6-8］，温俊达等［9］曾作过相应考察，但也未涉及上述项目。因此，本实验对鱼鳔质量标准进行了较系统的研究，鉴别项目包括性状、显微、TLC，检查项目包括水分、总灰分、酸不溶性灰分，含有量测定包括总氮、17 种常见氨基酸，以期为该药材现有质量标准提升，以及市场质量监控提供实验依据。

1 材料

1.1 仪器 101A-1 型电热鼓风干燥箱（上海申光仪器仪表有限公司）；SX2-4-10 型马弗炉（上海亚明热处理设备有限公司）；EL204 型电子天平［梅特勒-托利多仪器（上海） 有限公司］；KQ3200E型超声波清洗器（昆山市超声仪器有限公司）；HH-2 型数显恒温水浴锅（金坛市荣华仪器制造有限公司）；BX53 型正置荧光显微镜（日本Olympus公司）；DN-04C 型凯氏定氮仪（浙江托普仪器有限公司）；L-8900 型氨基酸自动分析仪（日本Hitachi 公司）；25 mL 酸式滴定管；定量滤纸（杭州沃华滤纸有限公司）；定性滤纸（杭州特种纸业有限公司）；微量进样器（上海高鸽工贸有限公司）。

1.2 试剂与药物 精氨酸对照品（批号110872-201207，中国食品药品检定研究院）；氨基酸混合物对照品［批号KPP5222，含天冬氨酸（Asp）、苏氨酸（Thr）、丝氨酸 （Ser）、谷氨酸 （Glu）、脯氨酸（Pro）、甘氨酸（Gly）、丙氨酸 （Ala）、半胱氨酸（Cys）、缬氨酸（Val）、蛋氨酸（Met）、异亮氨酸（Ile）、亮氨酸（Leu）、络氨酸（Tyr）、苯丙氨酸（Phe）、赖氨酸（Lys）、组氨酸（His）、精氨酸（Arg） 17 种常规蛋白水解液层析纯氨基酸，每种浓度为2.50 μmol／mL］、茚三酮溶液（批号KQF6365）、茚三酮缓冲液 （批号KQF6365）（日 本 Wako 公 司）；流动相 PH-1 （批 号A5259H1）、PH-2 （批号A5259H2）、PH-3 （批号A5259H3）、PH-4 （批号A5259H4）、PH-RG （批号A5259RG）。硅胶薄层板（青岛海洋化工厂分厂，烟台芝罘黄务硅胶试验厂）。鱼鳔共11 批，经山西中医药大学裴香萍副教授鉴定为正品，信息见表1。盐酸、氢氧化钠为分析纯；液氮纯度大于99.99%；水为娃哈哈纯净水。

表1 样品信息Tab.1 Information of samples

2 方法与结果

2.1 鉴别

2.1.1 性状 本品呈长圆形薄片或纺缍形筒状或小方块状，黄白色、淡黄色或黄棕色，角质样，略有光泽，半透明；质坚韧，不易撕裂，裂断处呈纤维性，气微腥，味淡。本实验比较了海鱼、河鱼鱼鳔的性状区别，主要体现在形状、大小、颜色等方面，见表2、图1。

2.1.2 显微 200 倍显微镜下，能明显观察到鱼鳔粉末中蛋白、平滑肌纤维，见图2。其中，蛋白呈球形或类球形，有的聚集成团，有的单个散在，多数具有凹陷或裂隙；平滑肌纤维常单个存在，有的成束成层存在，单个纤维多呈长条形，无横纹，常扭曲，长短不一，有的表面光滑，有的肌膜向下凹陷形成数量众多的小凹，有的表面带有毛刺。

表2 2 种鱼鳔性状区别Tab.2 Differences of characteristics between two kinds of fish maws

图1 2 种鱼鳔颜色和形状Fig.1 Colors and shapes of two kinds of fish maws

图2 鱼鳔显微特征（×200）Fig.2 Microscopic features of fish maws （×200）

2.1.3 TLC 参考文献［9］ 报道。取本品粉末0.1 g，加50 mL 稀盐酸加热回流2 h，滤过，滤液蒸干，残渣加5 mL 70%乙醇溶解，作为供试品溶液；另取精氨酸对照品，加70%乙醇制成每1 mL含0.25 mg 该成分的溶液，作为对照品溶液。按照2015 年版《中国药典》 四部0502 薄层色谱法，吸取上述溶液各1 μL，点于同一硅胶G 薄层板上，以正丁醇-冰醋酸-水（4 ∶1 ∶1） 为展开剂，展开，取出，晾干，喷以2%茚三酮丙酮溶液，105 ℃加热至斑点显色清晰，结果见图3。由此可知，供试品色谱在对照品相应位置上显示相同颜色斑点。

图3 鱼鳔TLC 色谱图Fig.3 TLC chromatogram of fish maws

2.2 检查

2.2.1 水分 根据2015 年版《中国药典》 四部0832 水分测定法第二法（烘干法） 进行测定，结果见表3。

表3 水分、总灰分、酸不溶性灰分、总氮含有量测定结果（n＝2）Tab.3 Results of content determination of water，total ash，acid-insoluble ash and total nitrogen （n＝2）

2.2.2 总灰分 根据2015 年版《中国药典》 四部2302 灰分测定法进行测定，结果见表3。

2.2.3 酸不溶性灰分 根据2015 年版《中国药典》 四部2302 灰分测定法进行测定，结果见表3。

2.3 含有量测定

2.3.1 总氮 根据2015 年版《中国药典》 四部0704 氮测定法进行测定，结果见表3。

2.3.2 氨基酸

2.3.2.1 色谱条件 参考文献［10-16］ 报道。分离柱为离子交换树脂2622 柱（4.6 mm×60 mm），反应柱为离子交换树脂2619 柱 （4.6 mm ×60 mm），除氨柱 为离子 交换树 脂 2650 柱（4.6 mm×40 mm）；分离柱流动相为B1～B4 （分别为pH 值1、2、3、4 的柠檬酸钠缓冲液），反应柱流动相为R1～R3 （为茚三酮溶液及其缓冲液），氨过滤柱流动相为B5～B6 （B5 为纯水，B6 为PHRG 缓冲液），梯度洗脱，程序见表4；分离柱柱温57 ℃，反应柱柱温135 ℃；分离柱体积流量0.400 mL／min，反应柱体积流量0.350 mL／min；双波长检测，VIS 1 检测除脯氨酸以外的氨基酸，波长570 nm，而VIS 2 检测脯氨酸，波长440 nm。进样量20 μL。在此条件下，17 种氨基酸分离效果均良好，见图4。

表4 梯度洗脱程序Tab.4 Gradient elution programs

2.3.2.2 对照品溶液制备 吸取40 μL 氨基酸混合物对照 品母液 （2.50 μmol／mL），加960 μL 0.02 mol／L 盐酸定容至1 000 μL，混 匀，即 得（0.10 μmol／mL），测定前经0.45 μm 微孔滤膜过滤。

图4 各氨基酸色谱图Fig.4 Chromatograms of various amino acids

2.3.2.3 供试品溶液制备 鱼鳔粉碎后过5 号筛，精密称取0.04 g 于25 mL 水解管中，加入10 mL 6.00 mol／L 盐酸，充氮气15 min 后封管，110 ℃水解24 h。取出冷却，滤过，精密吸取滤液5 mL 于25 mL 三角瓶中，6.00 mol／L NaOH 溶液调pH 至7.0，将其转移到25 mL 量瓶中，纯净水定容至刻度，精密吸取2.5 mL 于5 mL 量瓶中，0.02 mol／L盐酸定容至刻度，摇匀，即得，测定前经0.45 μm微孔滤膜过滤。

2.3.2.4 线性关系考察 精密吸取 “2.3.2.2”项下对照品溶液80 μL，加920 μL 0.02 mol／L 盐酸混匀，依次2 倍稀释成0.10、0.05、0.025、0.012 5 μmol／mL，在“2.3.2.1” 项色谱条件下进样20 μL 测定。以溶液浓度为横坐标（X），峰面积为纵坐标（Y） 进行回归，结果见表5，可知17种氨基酸在0.012 5～0.20 μmol／mL 范围内均呈良好的线性关系。

表5 各氨基酸线性关系Tab.5 Linear relationships of various amino acids

2.3.2.5 精密度试验 吸取0.10 μmol／mL 氨基酸混合物对照品溶液20 μL，在“2.3.2.1” 项色谱条件下进样测定6 次，测得Asp、Thr、Ser、Glu、Pro、Gly、Ala、Cys、Val、Met、Ile、Leu、Tyr、Phe、Lys、His、Arg 峰面积RSD 分别 为0.15%、0.11%、0.17%、0.15%、0.52%、0.24%、0.26%、0.22%、0.28%、0.30%、0.15%、0.12%、0.26%、0.25%、0.23%、0.21%、0.26%，表明仪器精密度良好。

2.3.2.6 稳定性试验 取同一供试品溶液（批号20140310），于 0、2、4、6、8、10 h 在“2.3.2.1” 项色谱条件下进样测定，测得Asp、Thr、Ser、Glu、Pro、Gly、Ala、Cys、Val、Met、Ile、Leu、Tyr、Phe、Lys、His、Arg 峰面积RSD分别为0.62%、0.91%、0.82%、0.52%、1.04%、0.31%、0.43%、0.41%、0.56%、1.06%、0.80%、0.66%、1.27%、0.50%、0.42%、0.71%、0.43%，表明供试品溶液在10 h 稳定性良好。

2.3.2.7 重复性试验 取同一批药材 （批号20140310），按“2.3.2.3” 项下方法平行制备6份供试品溶液，在“2.3.2.1” 项色谱条件下进样测定，测得Asp、Thr、Ser、Glu、Pro、Gly、Ala、Cys、Val、Met、Ile、Leu、Tyr、Phe、Lys、His、Arg 含有量RSD 分别为0.81%、1.58%、0.74%、0.79%、1.08%、0.44%、1.02%、2.43%、0.23%、1.83%、0.45%、0.59%、2.09%、1.07%、0.19%、0.93%、0.29%，表明该方法重复性良好。

2.3.2.8 加样回收率试验 取17 种氨基酸含有量已知的药材（批号20140310） 6 份，每份约0.02 g，精密称定，加入适量对照品溶液，按“2.3.2.3” 项下方法制备供试品溶液，在“2.3.2.1” 项色谱条件下进样测定，计算回收率。结果，Asp、Thr、Ser、Glu、Pro、Gly、Ala、Cys、Val、Met、Ile、Leu、Tyr、Phe、Lys、His、Arg 平均加样回收率分别 为 99.37%、99.33%、98.77%、98.75%、98.07%、100.4%、99.65%、99.87%、101.7%、97.80%、98.95%、99.03%、98.25%、99.23%、100.7%、101.5%、99.78%，RSD 分别为2.26%、2.44%、2.39%、2.29%、2.41%、2.02%、2.31%、2.35%、2.39%、2.09%、2.39%、2.02%、2.29%、2.26%、2.34%、2.34%、2.50%。

2.3.2.9 样品含有量测定 取11 批药材，每批2份，每份约0.04 g，精密称定，按“2.3.2.3” 项下方法制备供试品溶液，在“2.3.2.1” 项色谱条件下进样测定，计算含有量，结果见表6。

表6 各氨基酸含有量测定结果（mg／g， n＝2）Tab.6 Results of content determination of various amino acids （mg／g， n＝2）

3 讨论

目前，市场上常见海鱼鱼鳔，而鲜有河鱼鱼鳔。本实验除购买了1 批河鱼鱼鳔外，还曾另外购买了一些人工养殖大黄鱼及小黄鱼，将其解剖取鱼鳔，干燥后进行观察，但毕竟数量有限，其性状特征是否具有市场代表性还有待进一步探讨。

文献［9，17］ 报道，药材中提取氨基酸的方法大多为70%乙醇直接提取，但本实验发现采用该方法制备的鱼鳔供试品溶液在TLC 上始终无斑点呈现，后经酸水解处理后才清晰显现，表明鱼鳔中蛋白质含有量较高，而游离氨基酸较低。另外，TLC 鉴别时起初以丙氨酸为对照品，但在不同展开系统中斑点对齐情况并不理想，故又比对了9 种常见、价格适中氨基酸（亮氨酸、脯氨酸、苯丙氨酸、苏氨酸、组氨酸、L-谷氨酸、甘氨酸、缬氨酸、精氨酸） 与鱼鳔的薄层层析行为，发现精氨酸斑点重复性、对齐性最佳，故选择其作为对照品。

本实验首次考察了鱼鳔显微特征，但相对于组织结构明显的药材，鱼鳔显微特征很难考察。经反复实验、查阅书籍、与生物化学及病理专家交流后，最终确定鱼鳔粉末中明显存在的许多条或块状物及类球形物质分别为平滑肌纤维及蛋白质，这也是首次对动物此类特定组织的显微特征进行研究，以期为以后相关显微鉴别研究提供参考。此外还发现，只有直接刮取鱼鳔表面粉末并不能太细，才能观察到相对完整的平滑肌纤维及蛋白，若按照常规粉末显微鉴别制片方法则难以发现，这可能是之前尚无相关报道的原因之一。目前，市场上鱼鳔鉴别方法以性状鉴别为主，但对性状接近的伪品尚无有效的区分手段，而本实验发现的显微特征可快速有效地做到这一点，对市场监控具有积极意义。

文献报道，鱼鳔是一种高蛋白、低脂肪，含有丰富氨基酸的水产资源［5］，故本实验测定了其中总氮含有量以此评价蛋白质含有量。结果，11 批鱼鳔总氮含有量介于14.16%～18.45%之间，可见市售品蛋白质含有量差异不明显，并且海鱼、河鱼中亦然，表明不同鱼种鱼鳔的营养价值比较接近，也印证了其补益作用。

氨基酸具有多方面机能调节作用，如甘氨酸能维持中枢神经，提高免疫力，降低高胆固醇和高血脂；谷氨酸能解除氨对大脑的毒性，并促进消化道黏膜黏蛋白生成；精氨酸能促进生育及生长发育，促进创伤愈合及免疫调节能力［18］，故本实验采用氨基酸分析仪法分析了11 批鱼鳔中17 种氨基酸含有量，并在方法学考察时发现阴性无干扰，杂质及其他成分对含有量测定无影响，专属性良好。

另外，为了保证收集到的鱼鳔具有广泛的市场代表性，本实验购买的11 批样品分别来自国内三大药材市场，分别为河北安国药材市场4 批、四川荷花池药材市场4 批、安徽亳州药材市场3 批，能比较客观地反映该药材国内发展现状，以期为相关质量标准的修订提供依据。