加速溶剂萃取-气相色谱-串联质谱法测定烟丝中5种羧酸苯乙酯的含量及对烟丝加香的均匀性评价

吴若昕，张春涛，李登科，张小利，张建中，李海霞

(1.上海烟草集团有限责任公司 技术中心天津工作站，天津300163; 2.南开大学 化学学院，天津300071)

卷烟加香是制丝生产中的一道重要工序，加香的均匀性直接影响卷烟产品的质量稳定性[1-3]。目前行业主要通过计算添加到烟丝中的香精标记物含量的变异系数来评价加香工序的均匀性，文献中大多选取一种或少数几种香精组分作为标记物[4-7]。选取的标记物可能少量存在于烟丝中，对其测定结果造成干扰，或者虽在烟丝中未发现，但仅选取一种组分不足以系统评价整个加香工序[8-10]。因此，选取一系列香精和烟丝组分以外的化合物作为外加标记物，在卷烟加香均匀性研究中具有独特的优势，但目前尚未有相关文献报道。

对多种代表性烟用香精进行定性分析时发现香精中酯类化合物种类较多且对香气品质起关键作用。羧酸苯乙酯类化合物的结构和性质与香精中多种酯类化合物相似，在多种香精中未添加且不存在于烟草本底中，适量外加后不会对卷烟感官质量产生明显的影响，且沸点分布均匀，适合作为评价加香均匀性的外加标记物。本工作根据沸点均匀分布原则选取了甲酸苯乙酯、乙酸苯乙酯、丙酸苯乙酯、丁酸苯乙酯和苯乙酸苯乙酯等5种羧酸苯乙酯类化合物作为外加标记物，除了丙酸苯乙酯外，其他4种羧酸苯乙酯类化合物均收录在YQ 52－2015《烟草制品许可使用的添加剂名单》和YQ 53－2015《烟草制品临时许可使用的添加剂名单》中，丙酸苯乙酯虽未涵盖，但同属于常用的食用香精，可酌情使用。

加速溶剂萃取法(ASE)是利用液体溶剂对流动性差的样品进行萃取，通过增加萃取溶剂的温度和压力来提高被分析物的溶解性，降低溶剂黏度，加速溶剂向基体的扩散，从而提高萃取过程的速率和效率[11-12]。气相色谱-串联质谱法(GC-MS/MS)能有效降低背景噪声，改善选择性和灵敏性，具有很强的抗基质干扰能力，是复杂基质中痕量化合物检测的理想分析方法。本工作基于ASE的特殊构造，将烟草样品的提取过程和净化过程同时进行，采用GCMS/MS同时测定烟草中5种羧酸苯乙酯的含量，方法高效快速，定量准确，实际应用效果显著。

1 试验部分

1.1 仪器与试剂

7890A-7000B型气相色谱-串联质谱仪;Dionex ASE 350型加速溶剂萃取仪;KQ-600DE 型超声波清洗器;F-105 型循环冷却水泵;XS204 型电子天平;0.45μm 尼龙有机相过滤膜。

5 种羧酸苯乙酯的混合标准储备溶液:10.00 g·L－1，分别称取5 种羧酸苯乙 酯 标准品0.500 0 g，用正己烷溶解并转移至50 m L 容量瓶中，用正己烷定容，混合均匀，于4 ℃下保存备用。

5种羧酸苯乙酯的混合标准溶液:100 mg·L－1，移取5 种羧酸苯乙酯的混合标准储备溶液0.50 m L于50 m L容量瓶中，用正己烷定容，混合均匀，于4 ℃下保存备用。

内标储备溶液:10.00 g·L－1，称取乙酸苯甲酯基准品0.500 0 g，用正己烷溶解并转移至50 m L容量瓶中，用正己烷定容，混合均匀，于4 ℃下保存备用。

内标溶液:100 mg·L－1，移取内标储备溶液0.50 m L于50 m L容量瓶中，用正己烷定容，混合均匀，于4 ℃下保存备用。

5种羧酸苯乙酯的混合标准溶液系列:分别移取0.05，0.25，0.50，2.50，5.00 m L 的5种 羧 酸 苯 乙酯的混合标准溶液于50 m L 容量瓶中，各加入0.50 m L内标溶液，用正己烷定容，配制成0.10，0.50，1.00，5.00，10.00 mg·L－1的5种羧酸苯乙酯混合标准溶液系列。

甲醇、异丙醇、乙腈、正己烷、二氯甲烷和乙酸乙酯均为色谱纯;乙酸苯乙酯为分析纯;甲酸苯乙酯(纯度为95%)、乙酸苯乙酯(纯度为99%)、丙酸苯乙酯(纯度为98%)、丁酸苯乙酯(纯度为98%)和苯乙酸苯乙酯(纯度为98%)等5种标准品;内标物乙酸苯甲酯(纯度为98%)。

A 牌香精样品和A 牌卷烟样品由某卷烟厂提供。

1.2 仪器工作条件

1)萃取条件 萃取溶剂为正己烷;萃取温度为100 ℃;萃取压力为10.34 MPa;加热时间为5 min;静态萃取时间为5 min;氮气吹扫时间为60 s;循环次数为2次。

2)色谱条件 HP-5MS毛细管色谱柱(30 m×0.25 mm，0.25μm);进样口温度为290 ℃;载气为高纯氦气，纯度为99.999%;流量 为1.0 m L·min－1;进样量为1μL;分流进样，分流比为10∶1。柱升温程序:初始温度为60 ℃，保持2 min;以5 ℃·min－1的速率升温至280 ℃，保持10 min。

3)质谱条件 电子轰击离子源(EI);电离能量为70 e V;离子源温度为260 ℃;四极杆温度为150 ℃;传输线温度为280 ℃;多反应监测(MRM)模式;NIST 谱库。

其他质谱参数见表1。

表1 5种羧酸苯乙酯和内标物的质谱参数Tab.1 MS parameters of the 5 phenyl ethyl carboxylates and internal standard

1.3 试验方法

将烟丝样品置于温度(20±1)℃、相对湿度(60±3)%条件下平衡24 h。称取4.0 g样品置于34 m L萃取池中进行加速溶剂萃取，得到样品萃取溶液，向样品萃取溶液中加入质量浓度为100 mg·L－1的内标溶液0.50 m L，经过0.45μm尼龙有机相滤膜过滤，得到滤液，按照仪器工作条件进行测定。

2 结果与讨论

2.1 萃取方法的选择

试验比较了ASE和超声辅助萃取法(UAE)对5种羧酸苯乙酯的回收率和测定值相对标准偏差(RSD)的影响，结果见表2。

表2 ASE与UAE对5种羧酸苯乙酯回收率的比较(n＝6)Tab.2 Comparison on the recovery of the 5 phenyl ethyl carboxylates by ASE and UAE(n＝6) %

结果表明:ASE 和UAE 对5种羧酸苯乙酯的回收率和RSD 均满足要求，部分羧酸苯乙酯的回收率在ASE 条件下较UAE 条件下略高。这是由于ASE在高温、高压条件下进行，使得溶剂表面张力下降，提高了萃取效果;UAE在实验室较为普及，且操作简单;相比之下，ASE具有萃取时间短、自动化程度高、穿透能力强和萃取效率高等优点。试验选择的萃取方法为ASE。

2.2 加速溶剂萃取条件的选择

2.2.1 萃取溶剂

一般选用甲醇、异丙醇、乙腈、正己烷、二氯甲烷和乙酸乙酯等萃取溶剂提取烟草中的致香成分[13-14]。试验比较了上述不同种类的萃取溶剂对5种羧酸苯乙酯的萃取效果和基质干扰情况，结果见图1。

结果表明:甲醇和二氯甲烷对5种羧酸苯乙酯的回收率较大，但同时萃取出的杂质最多，造成色谱峰的基线位置升高，且存在基质效应影响测定结果的准确度;异丙醇和乙腈对5种羧酸苯乙酯的回收率较小，回收率为68.8%～89.5%;乙酸乙酯为萃取溶剂时，在16.84 min内，目标化合物出峰处有一个共流出物，不能完全分离。综合考虑，试验选择萃取效率较高且基质干扰较小的正己烷作为萃取溶剂。2.2.2 萃取温度

图1 不同种类的萃取溶剂对5种羧酸苯乙酯回收率的影响Fig.1 Effect of different extraction solvents on the recovery of the 5 phenyl ethyl carboxylates

萃取温度是影响ASE 萃取效果的最主要因素之一。提高萃取温度能提高目标物的溶解能力，降低溶剂与样品基体之间的作用力，提高萃取效率;但萃取温度过高可能导致目标物降解，同时导致溶剂密度增大，扩散系数降低，萃取效率降低。试验考察了萃取温度分别为60，80，100，120，140℃时对5种羧酸苯乙酯回收率的影响，结果见图2。

图2 不同萃取温度对5种羧酸苯乙酯回收率的影响Fig.2 Effect of different extraction temperatures on the recovery of the 5 phenyl ethyl carboxylates

由图2可知:当萃取温度为60，80℃时，甲酸苯乙酯的回收率较低，分别为78.1%，81.3%;当萃取温度为100 ℃时，5 种羧酸苯乙酯的回收率为95.5%～101%，满足分析要求;当萃取温度继续升高至120 ℃时，5种羧酸苯乙酯的回收率趋于稳定;继续升高萃取温度，5种羧酸苯乙酯的回收率反而降低。考虑到萃取温度越高消耗的能量越多，试验选择的萃取温度为100 ℃。

2.2.3 静态萃取时间

延长静态萃取时间能增加目标物向萃取试剂中扩散，进而提高萃取效率，但是高温条件下延长静态萃取时间可能会发生热降解，降低萃取效率。试验考察了静态萃取时间分别为5，10，15，20，25 min时对5种羧酸苯乙酯回收率的影响，结果见图3。

图3 不同静态萃取时间对5种羧酸苯乙酯回收率的影响Fig.3 Effect of different static extraction time on the recovery of the 5 phenyl ethyl carboxylates

由图3可知:当静态萃取时间为5 min时，5种羧酸苯乙酯的回收率为96.2%～104%;继续延长静态萃取时间，5种羧酸苯乙酯的回收率无显著性变化。为了缩短分析时间，试验选择的静态萃取时间为5 min。

2.2.4 循环萃取次数

试验将静态萃取时间分至不同的循环过程中，而非单纯延长单次萃取时间，能够在萃取中间引入新鲜溶剂，有助于保持溶剂与样品之间的平衡，特别是对于高含量样品或者难萃取的样品。试验考察了循环次数分别为1，2，3次时对5种羧酸苯乙酯回收率的影响，结果见图4。

图4 不同的循环次数对5种羧酸苯乙酯回收率的影响Fig.4 Effect of different cycling times on the recovery of the 5 phenyl ethyl carboxylates

由图4可知:当循环次数为2次时，5种羧酸苯乙酯的回收率达到较大值;继续增加循环次数，5种羧酸苯乙酯的回收率无显著性变化。为了减少有机溶剂的使用量，试验选择的循环萃取次数为2次。

2.2.5 样品量

当ASE中萃取溶液的体积一定时，烟丝样品量会影响方法的检出限和萃取效率。试验对样品量进行了选择。考虑到萃取池体积，试验考察了在相同萃取条件下3.0，4.0，5.0，6.0，7.0 g烟丝样品的萃取效率，结果见图5。

图5 不同的样品量对5种羧酸苯乙酯回收率的影响Fig.5 Effect of different amounts of sample taken on the recovery of the 5 phenyl ethyl carboxylates

由图5 可 知:当 烟 丝 样 品 量 为3.0，4.0 g 时，5种羧酸苯乙酯的回收率均较大，分别为90.1%～102%及93.1%～106%。由于样品量越大，方法检出限越低，试验选择烟丝样品量为4.0 g。

2.3 基质效应

烟草基质非常复杂，存在明显的基质效应，试验采用乙酸苯甲酯作为内标物，考察了内标法和外标法对消除基质效应的作用。按照试验方法对加标量为1.00μg·g－1的烟草样品进行测定，由内标法和外标法计算5种羧酸苯乙酯的加标回收率，结果见图6。

图6 5种羧酸苯乙酯在内标法和外标法下的回收率Fig.6 Recovery of the 5 phenyl ethyl carboxylates by internal and external standard methods

由图6可知:由外标法计算的5种羧酸苯乙酯的回收率明显高于内标法，这可能是由于基质成分的存在减少了色谱系统活性位点与目标物分子作用的机会，表现为基质增强效应，使得待测物的信号强度增强，表现为回收率偏高;而采用内标法计算的5种羧酸苯乙酯的回收率更接近于100%，说明试验采用内标法可以显著消除基质效应。

2.4 标准曲线与检出限

按照仪器工作条件对5种羧酸苯乙酯的混合标准溶液系列进行测定，以各羧酸苯乙酯的质量浓度为横坐标，与其对应的峰面积为纵坐标绘制标准曲线。结果表明:5 种羧酸苯乙酯的质量浓度均在0.10～10.00 mg·L－1内与其对应的峰面积之间呈线性关系，线性回归方程和相关系数见表3。

以3倍信噪比计算方法的检出限(3S/N)，结果见表3。

表3 线性参数和检出限Tab.3 Linearity parameters and detection limits

2.5 精密度和回收试验

平行称取空白卷烟样品6份，分别对其添加低、中和高等3种浓度水平的5种羧酸苯乙酯混合标准溶液，按照试验方法对其测定，计算5种羧酸苯乙酯的回收率和测定值的RSD，结果见表4。

表4 精密度和回收试验结果(n＝6)Tab.4 Results of tests for precision and recovery(n＝6)

空白卷烟样品和加标量为1.00μg·g－1的样品在MRM 模式下的色谱图见图7。

2.6 均匀性评价

2.6.1 含有外加标记物香精的制备及加香后烟丝的取样

香精制备:在A 牌香精中添加一定质量浓度的5种羟酸苯乙酯混合标准溶液，制成5种羧酸苯乙酯的质量浓度约为400 g·L－1的香精，用于卷烟加香。

烟丝加香:A 牌烟丝经过加香滚筒时，将含有5种羧酸苯乙酯的香精喷洒到烟丝中完成卷烟加香工序，加香工艺参数与在线保持一致。

加香后烟丝的取样:待设备运行平稳后，从加香滚筒出口固定位置取样，取样时间间隔1 min，每次取样100 g。

2.6.2 同一生产批次内卷烟加香均匀性

某生产批次A 牌烟丝按2.6.1节加香后取样，共取10个样品，标记为样品1～10，测定外加标记物的含量并计算其含量的变异系数CVi，表征5种羧酸苯乙酯加到烟丝中的均匀性，结果见表5。

5种羧酸苯乙酯的变异系数CVi依次为8.8%，6.4%，5.8%，8.1%，8.4%，均小于9%，代表该生产批次内卷烟加香均匀性良好。

2.6.3 不同生产批次间卷烟加香均匀性

A 牌烟丝连续10个生产批次，标记为批次1～10，按2.6.1 节加香后取样，测定外加标记物的含量，并计算其含量的变异系数CVi，表征5种羧酸苯乙酯加到烟丝中的均匀性，结果见表6。

5种羧酸苯乙酯的变异系数CVi依次为7.2%，8.4%，7.0%，6.8%，6.3%，均小于9%，代表不同生产批次间卷烟加香均匀性良好。

本方法为卷烟加香工序提供了一种高效、准确的评价方法，有助于卷烟产品的质量控制。

图7 MRM 模式下空白卷烟样品和加标样品的色谱图Fig.7 Chromatograms of blank and standard-added cigarette samples under MRM mode

表5 同一生产批次内烟丝中5种羧酸苯乙酯的加香均匀性评价Tab.5 Evaluation of aromatizing uniformity of the 5 phenyl ethyl carboxylates in cut tobacco from same production batch μg·g－1

表6 不同生产批次间烟丝中5种羧酸苯乙酯的加香均匀性评价Tab.6 Evaluation of aromatizing uniformity of the 5 phenyl ethyl carboxylates in cut tobacco from different production batches μg·g－1