超声快速石蜡与常规石蜡在胃肠道间质瘤Sanger测序中结果的对比分析

张 茜，杨月红，章宏峰

随着病理技术的发展，各种利用超声震动、恒温水浴和专用试剂对病理组织完成固定、脱水、透明全过程于一体的病理组织处理仪得到广泛应用，是目前国内病理科常用的快速制片方法之一[1]。因其方法简便快捷、省时省力，很多病理科会用超声快速石蜡方法对胃肠镜活检组织进行制片，据文献报道，在某些活检组织中，超声快速石蜡制片可以获得跟常规制片一致的HE染色的形态学结果[2]。在后续没有手术大标本的情况下，还需要用活检组织对胃肠道间质瘤(gastrointestinal stromal tumour, GIST)的患者进行Sanger测序检测C-Kit和PDGFRA基因突变的情况。本文主要探讨经超声快速脱水处理的组织在GIST Sanger测序中对C-Kit和PDGFRA基因突变检测结果的影响，以及与常规脱水组织在GIST Sanger测序中的C-Kit和PDGFRA基因突变检测结果的对比分析。

1 材料与方法

1.1 材料收集武汉市中心医院病理科2018年3～9月的胃肠道手术标本，每例标本常规取材时另在肿块相邻部位上取大小0.3 cm×0.3 cm×0.2 cm的组织2块分别进行超声快速脱水和常规脱水，制成蜡块后备用。待常规病理及免疫组化检测诊断后选取GIST 18例，其中男性8例，女性10例，患者年龄45～83岁，中位年龄66岁。仪器设备为HT-3型快速组织处理系统(山东骏腾医疗科技公司)和全自动密闭式组织脱水机(Leica ASP300S)，GIST C-it和PDGFRA基因突变检测试剂盒购自上海源奇生物公司。

1.2 方法

1.2.1组织处理 将所取每例组织大小0.3 cm×0.3 cm×0.2 cm的2块组织中的一块立即放入快速组织处理仪中进行超声快速石蜡制片，超声快速石蜡制片方法如下：将组织放入第一缸的快速处理液中处理10 min；再将组织浸入第二缸的快速处理液中处理10 min；用滤纸吸取组织表面残留的处理液，放入预先融化的石蜡中10 min，等到组织完全下沉不再有气泡为止。取出组织迅速置于石蜡包埋机中进行石蜡包埋。另一块行常规石蜡处理。待常规病理及免疫组化检测确诊为GIST后，将两种方法制得的蜡块同时进行C-Kit和PDGFRA基因检测。

1.2.2核酸提取 取已制备好的同一患者的常规石蜡组织和超声快速石蜡组织蜡块，每块切片10张，厚度为3 μm，制成组织切片，取连续切片的第一张和最后一张切片做常规HE染色，评估肿瘤细胞的含量和比例。根据评估的结果刮取肿瘤组织细胞到1.5 mL的EP管中，加入二甲苯1 mL脱蜡，离心去上清后加入无水乙醇，再离心去上清后将组织放置在通风处烘干。在EP管中加入180 μL的ATL消化液和20 μL的蛋白酶K，于56 ℃的水浴锅中消化3 h，90 ℃水浴锅中孵育1 h，样本室温冷却后，加入200 μL的DNA结合液和200 μL的无水乙醇，振荡混匀离心后过吸附柱，经2轮洗涤后，加入ATE缓冲液回收富集DNA。

1.2.3核酸定量 用Nanodrop 2000分光光度计对提取的DNA进行测量，确定核酸的浓度和纯度。

1.2.4PCR扩增 根据上海源奇生物公司的肿瘤相关基因突变检测试剂盒说明书的要求配置PCR MIX混合体系，加22 μL的需要扩增的外显子反应液和3 μL的DNA，总反应体系为25 μL。扩增条件为：42 ℃预处理5 min，94 ℃预变性5 min，94 ℃变性15 s，60 ℃退火25 s，72 ℃延伸1 min，扩增40个循环后，72 ℃延伸10 min。

1.2.5酶消化 取5 μL的PCR扩增产物，加2 μL的SAP MIX酶进行酶消化，消化程序设置为37 ℃孵育1 h，85 ℃处理15 min。

1.2.6测序PCR扩增 根据试剂盒说明书配置测序PCR反应体系，取3 μL的酶消化产物，加入2 μL的测序引物和1 μL的Bigdye液，总反应体系为6 μL。扩增条件为：96 ℃预变性1 min，96 ℃变性10 s，50 ℃退火5 s，60 ℃延伸5 min，扩增30个循环，产物放置在4 ℃冰箱内保存。

1.2.7测序PCR产物纯化 每个0.2 mL的EP管中加入3 μL的0.125 mol/L的EDTA，再加入30 μL的无水乙醇，震荡3次后室温放置15 min；12 000 r/min离心30 min，弃去上清液；加入70 μL预冷的70%乙醇，冷冻离心机4 ℃ 12 000 r/min离心15 min，弃上清；加入70 μL 预冷的70%乙醇，冷冻离心机4 ℃ 12 000 r/min离心15 min，弃上清；将离心管放置在通风处，使乙醇彻底挥发；加入10 μL的Hi-Di Formamide变性剂，迅速置于95 ℃的水浴锅中孵育5 min，取出置于冰上。

1.2.8上机测序 纯化后的产物即可在ABI 3500Dx基因分析仪上测序并分析。

2 结果

2.1 病理质控行常规HE染色，同一患者超声快速石蜡切片组织结构清晰，染色对比鲜明，与常规石蜡切片质量差异无显著性，两种HE切片的形态学结果一致，病理诊断为GIST，镜下肿瘤细胞的比约占整张切片的60%(图1)。

AB

图1胃肠道间质瘤标本镜下所见：A.超声快速石蜡处理；B.常规石蜡处理

2.2 核酸的浓度和纯度超声快速石蜡处理的组织和常规石蜡处理的组织提取核酸浓度和纯度均可以满足下游测序的要求，两者差异无显著性(P>0.05，图2)。

2.3 测序结果在18例GIST中，超声石蜡Sanger测序检测的结果中，C-Kit 11号外显子基因突变16例，PDGFRA基因18号外显子突变2例(表1)。同一患者经Leica常规脱水机石蜡包埋处理的组织和经HT-3型超声波组织快速处理仪处理的组织样本在测序片段的大小、背景荧光信号值、正常荧光信号峰和突变荧光信号峰上与常规石蜡样本无明显差异(图3、4)。18例GIST基因测序结果完全一致(表1)。

图2 超声快速石蜡处理和常规石蜡处理的胃肠道间质瘤标本提取的核酸浓度(A)和纯度(B)

图3 胃肠道间质瘤标本超声快速石蜡基因检测：NM_000222.2: c.1679T>A(p.V560D)

图4 胃肠道间质瘤标本常规石蜡基因检测：NM_000222.2: c.1679T>A(p.V560D)

3 讨论

GIST是消化道的一种间叶源性肿瘤，约占全部胃肠道肿瘤的2%[3]。在近20年的研究中，GIST已经成为精准医学时代针对特定基因的靶向治疗的成功范例，靶向药物伊马替尼(Imatinib)对C-Kit基因11号外显子突变的患者疗效最佳[4]。另外，在病理诊断中，对于部分形态学符合间质瘤梭形细胞或上皮样细胞特点、而免疫组化标记CD117和DOG1双阴性或只有一个指标阳性的病例，若Sanger测序中C-Kit和PDGFRA基因突变阳性，病理医师可依据分子检测的结果诊断为GIST[5-6]。因此在胃肠道组织中进行Sanger测序检测C-Kit和PDGFRA基因突变状况不仅可以预示患者对靶向药物的疗效，还可以帮助病理医师辅助鉴别诊断GIST[6]。

表1 C-Kit(NM_000222.2)和PDGFRA(NM_006206.4)基因突变的检测结果

早期的GIST绝大部分病灶较小且患者无临床症状，很多是通过体检或活检偶然发现[3-4]。在病理科对活检组织进行超声快速石蜡制片广泛应用的今天，有部分的胃肠道活检组织形态学观察怀疑是GIST但免疫组化标记CD117和DOG1双阴性或只有一个指标阳性时，可以直接使用超声快速石蜡制片的活检标本进行C-Kit和PDGFRA基因突变的检测以辅助诊断GIST。临床需要考虑使用Imatinib治疗时，需要先明确C-Kit和PDGFRA基因的突变状态，这种情况下也可以选用超声快速石蜡处理的标本。

常规石蜡组织是新鲜标本经10%中性福尔马林固定6～24 h，再经过由低至高各级浓度的乙醇逐级脱水，二甲苯透明以及浸蜡等程序制成，该流程耗时10～20 h。目前HE和分子病理的诊断标准均是根据组织经常规石蜡包埋制片而制定的。超声快速石蜡是病理技术中的特殊领域，应用环保型生物组织处理试剂结合HT-3处理仪处理病理组织是利用超声原理，在处理液中快速振荡病理组织和有机溶剂，实现周期性缩张的效果，进而提高分子运动的速率，加速液体交换，使得细胞渗透性、溶剂分子穿透力显著增强，最终实现病理组织的快速处理和诊断。该方法操作简便、安全可靠、省时省力，仅需30 min左右，3个步骤就可完成脱水、透明和浸蜡的全部流程，与常规石蜡制片相比虽然可以大大缩短制片时间[1-2]。但由于在脱水过程中超声快速石蜡组织未经10%中性福尔马林充分固定，用了环保型生物组织处理试剂结合超声波的作用处理组织。在分子检测中其核酸质量和基因检测结果与常规脱水组织是否一致，目前还尚无大量文献报道。

在超声快速石蜡组织脱水过程中所用环保型生物组织处理试剂大多是醇性试剂，能有效保存核酸成分，而且Sanger测序检测方法对核酸的质量和浓度的要求比较高，本实验证实超声快速石蜡组织脱水过程中超声波和生物组织处理试剂对核酸的质量和浓度无影响，且不影响下游的C-Kit和PDGFRA基因突变检测的结果。在临床只有超声快速石蜡标本的情况下，可以用超声快速石蜡组织行GIST的C-Kit和PDGFRA基因突变检测，以便辅助诊断和预示靶向治疗效果。需要注意的是超声快速脱水的组织取材大小不能过厚，以免组织脱水不彻底影响制片质量和蜡块的保存，另外在提取核酸时尽量选择已通过CFDA认证的商品化的核酸提取试剂盒。