三阴型乳腺癌中RHBDD1和EGFR的表达及相关性分析

居红格，李 峰，马俊兵，张文连，贺 帅，张 伟

乳腺癌是女性常见的恶性肿瘤之一，严重危害女性生命健康。乳腺癌是一组高异质性的肿瘤，不同分子亚型其临床病理特点、治疗方法及预后各不相同。其中三阴型乳腺癌(triple negative breast cancer, TNBC)约占所有乳腺癌总数的13%[1]。与其它分子亚型相比，TNBC侵袭性强、易转移、预后较差。本实验采用免疫组化、酶联免疫和qRT-PCR技术检测TNBC组织和血清中RHBDD1和EGFR mRNA含量及蛋白表达，为TNBC治疗寻找新的靶点。

1 材料与方法

1.1 临床资料选取2015年～2018年在包头医学院第一附属医院及包头市肿瘤医院行乳腺癌根治性切除术的患者为研究对象，每例均切取乳腺癌组织及对应癌旁正常乳腺组织，用于提取RNA及石蜡包埋。采集乳腺癌患者血清储存于-80 ℃用于酶联免疫检测，随机选取60例健康体检者(无肿瘤病史及家族史)血清作为对照组。对所有乳腺癌组织进行ER、PR、HER2免疫组化检测，30例ER、PR、HER2均阴性，为TNBC组，从其余乳腺癌患者中随机选取30例作为非三阴型乳腺癌(non triple negative breast cancer, NTNBC)组(ER、PR、HER2至少一项阳性)，所选病例患者年龄26～82岁，中位年龄51岁。按照Nottingham组织学分级系统[2]进行计分及组织学分级，根据腺管数量(1～3分)、核异型程度(1～3分)、核分裂项计数(1～3分)计分，Ⅰ级3～5分，Ⅱ级6～7分，Ⅲ级8～9分；所有病理切片均由两位高级职称病理医师采用双盲法进行判读。采用美国癌症联合委员会(AJCC)乳腺癌TNM分期进行临床分期。

1.2 方法

1.2.1免疫组化 采用免疫组化MaxVision法进行免疫组化染色，手术切除标本先经10%中性福尓马林固定，然后脱水、石蜡包埋、脱蜡、水化、抗原修复、滴加抗体、DAB显色、复染、封片。试剂盒购自福州迈新公司，所有操作步骤均严格按照试剂盒说明书进行。

结果判定标准：所有结果均经诊断医师采用双盲法进行确认。根据染色程度进行评分：基本不着色为0分，淡黄色为1分，棕黄色为2分，深棕色为3分。每张切片随机选取5个高倍视野，计算出每个视野阳性染色肿瘤细胞的百分数，并取其平均值进行评分：阳性染色肿瘤细胞的百分数<1为0分，10%～24%为1分，25%～49%为2分，50%～74%为3分，75%～100%为4分。最后将两项评分结果相乘：0分为阴性(-)；1～12分阳性。其中l～4分为(+)，5～8分为()，9～12分为()。

1.2.2酶联免疫法 检测乳腺癌患者血清中RHBDD1和EGFR蛋白，试剂盒均购自武汉新启迪生物公司。从已平衡至室温的密封袋中取出试验所需的板条，预留空白孔，分别将标本加入相应孔中37 ℃孵育90 min，洗板2次，加入生物素化人RHBDD1或EGFR抗体工作液，37 ℃孵育60 min，洗板3次，除空白孔外，加入酶结合物工作液。37 ℃避光孵育30 min，洗板5次。加入酶结合物工作液，37 ℃避光孵育，当标准曲线高浓度的颜色较深，有明显的颜色梯度时即可终止。加入终止液，混匀后即刻测量OD(450 nm)值。

1.2.3qRT-PCR 采用qRT-PCR技术检测乳腺癌中RHBDD1 mRNA的含量。RNA提取试剂盒(DP431)购自天根生化公司，反转录试剂盒(#k1621)购自Thermo Scientific公司。qRT-PCR试剂盒(B532955)购自上海生工生物公司。RHBDD1、EGFR和β-actin的引物序列由上海生工生物公司合成。β-actin的引物序列：上游5′-TGTCCCTGTA CACCTCTG-3′，下游5′-ATGTCACGCACGATTTCCC-3′，扩增产物长度为217 bp。RHBDD1的引物序列：上游5′-GCCTATGTTATCACCGCATTTTC-3′，下游5′-GCTCCTTTTGAAGTCAGGTTCAT-3′，扩增产物长度为102 bp。EGFR引物序列：上游5′-GGACTCTGGA TCCCAGAAGGTG-3′，下游5′-GCTGGCCATCACG TAGGCTT-3′，产物大小为244 bp。qRT-PCR的反应体系为20 μL，反应条件为恒温段：95 ℃ 30 s，循环段：95 ℃ 5 s ，然后60 ℃ 30 s ，熔解段：95 ℃ 15 s，60 ℃ 1 h，95 ℃ 15 s，共40个循环。

记录CT值，计算ΔCT和ΔΔCT值，最后结果取ΔΔCT的均值，即为RHBDD1 mRNA和EGFR mRNA的相对含量。

1.3 统计学分析采用SPSS 17.0软件进行统计学分析，计数资料比较采χ2检验，计量资料比较采用t检验，相关性分析采用r相关性分析和Spearman秩相关检验，P<0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 乳腺癌组织中ER、PR、HER2的表达ER、PR阳性定位于细胞核，HER2阳性定位于细胞膜，与乳腺癌诊疗规范(2018)评定标准一致。把ER、PR、HER2均阴性归为TNBC组，把ER、PR、HER2至少一项阳性归为NTNBC组。

2.2 TNBC和NTNBC组织中RHBDD1和EGFR的表达采用免疫组化法对TNBC和NTNBC组织和癌旁组织中RHBDD1和EGFR蛋白进行检测，结果显示RHBDD1阳性定位于细胞质和细胞膜，EGFR阳性定位于细胞膜(图1、2)，RHBDD1在TNBC组中的阳性率(83%)高于NTNBC组(67%)，差异有统计学意义(P<0.05)，EGFR在TNBC组中的阳性率(80%)明显高于NTNBC组(37%)，两组相比差异有统计学意义(P<0.05)。RHBDD1和EGFR在TNBC中的表达呈正相关(r=3.723，P<0.05)。RHBDD1和EGFR在TNBC组和NTNBC组中的表达均与患者年龄无关，与临床分期、组织学分级、肿瘤大小、淋巴结转移及远处转移有关(表1)。

2.3 乳腺癌患者和健康体检者血清中RHBDD1和EGFR的浓度采用酶联免疫法对60例乳腺癌患者和60例健康体检者血清进行RHBDD1和EGFR检测，结果显示乳腺癌患者血清中RHBDD1、EGFR含量明显高于对照组，差异有统计学意义(P<0.05)。TNBC组RHBDD1、EGFR的含量高于NTNBC组，差异有统计学意义(P<0.05，图3)。

2.4 TNBC和癌旁正常乳腺组织中RHBDD1 mRNA和EGFR mRNA的含量以β-actin为内参，应用qRT-PCR技术对30例TNBC和癌旁正常乳腺组织中RHBDD1和EGFR进行检测，扩增的产物经2%的凝胶电泳，证实为RHBDD1、EGFR，长度分别102、244 bp(图4)。

表1 三阴型乳腺癌和非三阴型乳腺癌组织中RHBDD1和EGFR的表达与临床病理特征的关系[(n)%]

①A①B②A②B

图1非三阴型乳腺癌中RHBDD1(A)和EGFR(B)呈强阳性，MaxVision法图2非三阴型乳腺癌中RHBDD1(A)和EGFR(B)呈阴性，MaxVision法

图3 不同组别血清中RHBDD1和EGFR浓度检测NTNBC组. 非三阴型乳腺癌组；TNBC组. 三阴型乳腺癌组

图4 三阴型乳腺癌组织中RHBDD1、EGFR基因扩增PCR凝胶电泳：M.Marke；1～3.EGFR；4～6.RHBDD1

TNBC组中RHBDD1 mRNA和EGFR mRNA的含量均高于癌旁正常组，分别是3.68倍和4.56倍，淋巴结转移组中RHBDD1 mRNA和EGFR mRNA的含量分别是无淋巴结转移组中的4.72倍和5.31倍，远处转移组的RHBDD1 mRNA和EGFR mRNA的含量显著高于无远处转移组，分别是4.89倍和5.55倍(图5)，差异均有统计学意义(P<0.05)。

图5 三阴型乳腺癌组织中RHBDD1 mRNA、EGFR mRNA的相对含量

3 讨论

TNBC是乳腺浸润癌的一种分子亚型，不表达ER、PR和HER2，TNBC患者的内分泌治疗和抗HER2的靶向治疗效果不佳，且预后差，易复发，易侵袭转移，病死率较高。现在对于TNBC患者，主要是行常规手术切除治疗和化疗[4-5]，也有学者对晚期TNBC患者进行全身治疗的诸多试验正在进行，并取得了一定成果[6]。近几年，国内外研究者寻求TNBC治疗的新分子靶点，针对TNBC患者采用个体化靶向治疗，使乳腺癌患者最终受益。

EGFR是表皮生长因子受体家族的一个成员，其可以激活下游通路，导致细胞增殖分化，促使肿瘤形成。国内外许多研究结果表明EGFR在乳腺癌、胃癌、结肠癌等许多肿瘤中出现异常高表达，其通过激活下游信号通路，促进肿瘤细胞增殖、侵袭及转移[7-9]。

本实验采用免疫组化法检测EGFR在TNBC组织中高表达，与文献报道结果一致[10]。采用酶联免疫法检测乳腺癌患者血清中EGFR的表达，血清中EGFR含量高于健康人群，TNBC组患者血清中EGFR的含量明显高于NTNBC组。现在国内外研究对EGFR下游通路活化的机制较为清楚，但是如何调控和激活EGFR一直是众多研究者所关注的热点。本实验组在前期实验[11]发现RHBDD1和EGFR在乳腺癌中的表达呈正相关，RHBDD1可能激活EGFR，诱导肿瘤细胞增殖、转移。

RHBDD1是新发现的Rhomboid家族成员，Rhomboid家族包含一个特殊的丝氨酸蛋白酶结构域，是一类能够切割单一跨膜蛋白结构域的丝氨酸蛋白酶，具有促进细胞增殖、抑制细胞凋亡的作用[12-13]，有文献报道[14]RHBDD1在乳腺癌组织中高表达，本实验组从乳腺癌患者组织和血清中发现RHBDD1高表达，尤其是TNBC组明显高于NTNBC组，相关性分析结果表明RHBDD1表达与TNBC的发病年龄无关，与临床分期、病理分级、肿瘤大小、淋巴结转移、远处转移有关，进一步分析发现，TNBC组中RHBDD1和EGFR表达呈正相关。提示RHBDD1可能在癌组织中发挥上调EGFR蛋白的作用，激活EGFR下游通路，促进肿瘤的发生、发展。有研究[15]证实RHBDD1可以通过调节C-Jun的表达来调节EGFR mRNA的表达。随后对TNBC组织提取的RNA进行了qRT-PCR检测，结果表明在TNBC组织中RHBDD1 mRNA和EGFR mRNA的含量高于癌旁组织，发生淋巴结转移和远处转移的组织中，尤其是发生远处转移的组织，RHBDD1 mRNA和EGFR mRNA的含量更高，从核酸水平进一步证实RHBDD1和EGFR在TNBC发生和转移中发挥重要作用。

本实验从组织和血清两方面进行检测，检测到RHBDD1和EGFR蛋白在TNBC中高表达，从蛋白和RNA水平两方面均说明RHBDD1和EGFR在TNBC的发生和转移中具有协同作用，RHBDD1和EGFR可作为TNBC预后和临床诊疗的分子靶点，为TNBC的临床诊治提供新的理论基础。