慢性HBV感染患者细胞免疫与miRNA-155表达相关性探究

梁 骑，杨尚瑜，邓健康，王东生，郭晓兰*

(1.川北医学院附属医院 检验科，四川 南充637100；2.川北医学院 转化医学研究中心，四川 南充637100)

微小核糖核酸(miRNA)是近年来发现的非编码单链RNA，其长度在21-25个核苷酸范围内，其以序列特异性方式转录后，对人体的基因表达进行调控[1]。miRNA对靶基因表达进行调节的途径主要是通过与靶基因mRNA的3’非翻译区结合，其结合方式有完全和不完全互补两种形式[2]。miRNA-155是由B细胞非编码基因整合集群中(21号染色体内)第3个外显子编码而成，数项研究表明该miRNA参与了人体多项生物学功能如炎症、心血管疾病以及肿瘤的发生和免疫功能等[3-5]。近年来，有研究报道称HBV病毒感染同样有miRNA-155参与在内[6]，但其中两者的具体相关性鲜有报道，本研究针对miRNA-155与慢性HBV感染患者展开相关性研究，初步探求两者具体相关性，现报道如下。

1 资料与方法

1.1 一般资料

选取2018年2月到2019年2月我院收治的慢性HBV患者40例设为观察组，纳入标准：(1)符合《慢性乙型肝炎防治指南2015年版》[7]的诊断标准；(2)入院前6个月内未接受免疫调节剂治疗；(3)预计生存时间>1年。排除标准：(1)先天性或获得性免疫缺陷；(2)肝癌患者；(3)存在重要脏器功能障碍者。选取同期入院检查的健康个体40例设为对照组，所有人员签署知情同意书，并经我院医学伦理会批准。

1.2 方法

采集所有人员禁食12 h后空腹静脉血4 ml两份，其中一份3 370×g离心10 min，取上清液并转移至两份1.5 ml无菌去酶离心管中，于-80℃环境下保存备用，提取miRNA，逆转录成互补DNA，采用荧光定量PCR检测miRNA-155水平，以cel-mir-39-3p为外参基因对其进行相对表达量的校准，并采用2-ΔΔCt法计算相对表达量；另外一份血液样本于流式试管中立即加入抗凝血CD4异硫氰酸荧光、CD8藻红蛋白各100uL，以及CD3多甲藻黄素—叶绿素—蛋白质复合物等20 μl(均购自美国BD公司)，依次经过避光反应、红细胞裂解、离心、弃上清后，加入磷酸盐缓冲液1 ml，1000×g离心5 min并弃上清后，再次补入磷酸盐缓冲液500 μl，混合均匀后使用流式细胞仪(型号BD FACS Calibur)进行检测，以 SSC/CD3作为设门，分别记录抑制/细胞毒性T淋巴细胞(CD3+、CD4、CD8+)，以及辅助/诱导T淋巴细胞(CD3+、CD4+、CD8-)等的百分比，最后计算辅助/抑制T淋巴细胞(CD4+/CD8+)比值。

1.3 统计学处理

所有统计学资料都采用SPSS25.0专业统计学软件进行数据分析，计量资料以均数±标准差表示，组间比较采用独立样本t检验，而所有的计数资料用χ2检验。对所有观测指标进行进行单因素分析，并进一步进行多因素回归分析。所有统计结果P<0.05评价为差异具有显著性。

2 结果

2.1 两组人员基线资料的比较

两组人员除性别、年龄比较无明显差异外(P>0.05)，观察组CD3+、CD4+以及CD4+/CD8+明显低于对照组，且miRNA-155相对表达量明显低于对照组，差异具有统计学意义(P<0.05)；CD8+百分率两组相比无明显差异，不具统计学意义(P>0.05)，见表1。

表1 两组人员基线资料的比较

2.2 多因素线性回归分析

以miRNA-155相对表达量作为因变量，以T细胞亚群各指标含量作自变量，进行多因素线性回归分析，结果显示：CD3+百分率与miRNA-155呈正相关(B=0.050，P=0.000，95%CI=0.037-0.064)，其余指标与miRNA-155并未表现出相关性(P>0.05)，见表2。

表2 多因素线性回归分析结果

2.3 多因素Logistics回归分析

以观察组与对照组miRNA-155相对表达量作为区分标准，建立状态变量(观察组患者miRNA-155=0，对照组miRNA-155=1)，同样将所有人员T细胞亚群各指标含量作自变量，进行多因素Logistics回归分析，结果显示：CD3+百分率与miRNA-155表现出相关性(B=0.601，P=0.008，95%CI=1.171-2.838)，其余指标与miRNA-155并未表现出相关性(P>0.05)，见表3。

表3 多因素Logistics回归分析结果

3 讨论

人体细胞免疫与多种疾病发病相关。谢服役等在其研究中表示[8]，慢性HBV患者病理损伤机制多样，而患者所出现的细胞免疫功能紊乱是一种主要病理损伤机制。正常健康人体的T淋巴细胞构成主要包括CD3+、CD4+以及CD8+T细胞3种细胞组成，在无任何免疫性疾病、严重并发症等发病情况下，人体外周血T淋巴细胞亚群一直处于动态平衡状态[9]；HBV病毒感染至乙肝病发的整个过程中，人体外周血T细胞亚群各类细胞数量会发生变化，同时其占比也会发生相应改变，T淋巴细胞原本的分布结构发生改变，患者机体逐渐出现免疫应答反应，致使患者肝细胞受到损伤，最终患者乙肝病情发展及疾病转归都会受到较大影响[10]。miRNA-155在人体内多种免疫细胞中均有所表达，其中包括有：树突状细胞、巨噬细胞、T细胞、B细胞等，该miRNA主要起到对人体正常的免疫机制进行调控的作用，Sarkar N等在其研究中[11]就肝病患者的miRNA-155表达量进行了对照分析，结果发现慢性乙肝患者的外周血单核细胞内miRNA-155表达量相较于健康人群出现了明显的下降；本研究结果显示：两组人员除性别、年龄比较无明显差异外(P>0.05)，观察组CD3+、CD4+以及CD4+/CD8+明显低于对照组，且miRNA-155相对表达量明显低于对照组，差异具有统计学意义(P<0.05)，结果与其报道的类似，根据以上单因素分析比较我们可以发现，患者T细胞亚群各细胞含量均与miRNA-155表达量出现同步下降的趋势，提示miRNA-155表达与慢性HBV感染患者细胞免疫可能存在一定相关性。

根据本研究结果的相关性研究结果显示：以miRNA-155相对表达量作为因变量，以T细胞亚群各指标含量作自变量，进行多因素线性回归分析，结果显示CD3+百分率与miRNA-155呈负相关(B=-0.050，P=0.000，95%CI=-0.064～-0.037)；以观察组与对照组miRNA-155相对表达量作为区分标准，建立状态变量(观察组患者miRNA-155=0，对照组miRNA-155=1)，同样将所有人员T细胞亚群各指标含量作自变量，进行多因素Logistics回归分析，结果显示CD3+百分率与miRNA-155表现出相关性(B=0.601，P=0.008，95%CI=1.171-2.838)，该结果表明CD3+百分率与患者miRNA-155表达量表现为正相关，这可以说明miRNA-155确与慢性HBV患者细胞免疫存在相关性。miRNA-l55表达量对于T细胞亚群含量起着至关重要的作用：当患者miRNA-155表达量上升时，其可对患者机体内B细胞信号转导产生一定增强作用，同时可以刺激患者机体产生高亲合力抗体，并可能逐步引导患者T细胞向辅助性T细胞分化[12]；但当患者miRNA-155出现下降时，其机体免疫功能容易表现为抑制状态，T细胞亚群各细胞含量则会出现下降，王颖智[13]等在其研究中对慢性乙肝患者血清中miRNA-155表达量下降的原因进行了推测，结果表明，慢性乙肝患者血清中miRNA-155表达量相较于健康人群体内miRNA-155表达量明显更低，该现象可能由于慢性乙肝患者Toll样受体7通过NF-JB通路进行作用，以此抑制了miRNA-155在其体内的正常表达，进而使得患者出现免疫功能抑制，细胞免疫能力下降的现象，该情况可通过使用抗病毒药物进行缓解。

综上所述，慢性HBV感染患者的miRNA-155表达量相较于正常人群明显更低，这与其细胞免疫能力的抑制表现出了相关性，但该研究结果仅仅发现T细胞亚群中CD3+百分率与miRNA-155表达量呈正相关，但本研究例数有限，无法确定其准确性，仅供参考。