臭氧大自血法对睡眠剥夺大鼠褪黑素及氧化应激指标的影响

税云华, 张 兰, 雷光磊, 诸源江, 李培玉

(四川省骨科医院麻醉科, 成都 610041)

失眠症是以睡眠障碍为主要表现的一种疾病。随着社会的发展和各方面压力的增大，失眠症已经普遍存在于成年人群中[1]。最新的一项流行病学调查显示，全世界范围内，有接近30%的人群受失眠症的困扰，严重影响了人类的身心健康[2]。尽管睡眠对人类的意义重大，但关于睡眠和失眠的机制研究却不甚清楚。对于失眠症的治疗方法也在逐渐探索中。目前治疗失眠症的药物主要以镇静、催眠类药物为主，但长期大量服用容易引起药物成瘾，且不良反应较大[3-5]。臭氧(O3)具有极强的氧化作用和较高的能量，是构成自然界大气的成分之一。既往研究证实，臭氧治疗局部感染有着良好的效果[6]；也有学者采用臭氧自体血回输技术治疗急性期脑梗死并取得了显著的疗效[7]。随着对臭氧研究的深入，国内已有报道，臭氧大自血法对于失眠症的治疗也具有益处[8]，但其机制却在探索中。为了深入探讨臭氧大自血法治疗失眠症的可能机制，本研究通过构建睡眠剥夺大鼠模型，并用臭氧大自血法进行干预，观察大鼠血清褪黑素和氧化应激指标的变化。现将结果报道如下。

1 材料与方法

1.1 实验动物

SPF 级雄性Wistar 大鼠40 只，9 周龄，体质量(300±30) g，购自成都达硕实验动物有限公司[SCXK(川)2015-030]。所有大鼠均于实验前在昼夜明暗12 h∶1 2 h(07∶00 开灯, 19∶00关灯)、通风良好、正常饮食条件下适应性饲养观察7 d，并于成都中医药大学中医内科脏腑病症实验室[SYXK(川)2017-179]完成实验。

1.2 实验材料

Hyper-Medozon comfort医用臭氧发生器(德国赫尔曼公司)发生的臭氧，回输专用真空注射器(上海康德莱企业发展集团股份有限公司，批号20190200)；大鼠血清褪黑素检测试剂盒(上海信裕生物工程有限公司，批号XY-E30014-18192)，大鼠血清超氧化物歧化酶(SOD)检测试剂盒(上海泽叶生物科技有限公司，批号ZY-SOD-Ra18057)，大鼠血清谷胱甘肽过氧化物酶(GSH-px)检测试剂盒(上海抚生实业有限公司，批号fs-E 5 8 0 9-18133)，大鼠血清丙二醛(MDA)检测试剂盒(上海信裕生物工程有限公司，批号X Y-E 3 0 2 6 6-181072)。

1.3 实验仪器

按文献[9]自制睡眠剥夺箱(127 cm×44 cm×45 cm，材质为有机玻璃)(图1)，在箱内底部装有14 个直径为6.5 cm 的平台。实验开始前，向箱内加水至距离平台1 cm 处。

1.4 造模方法

造模时，每次将10 只大鼠分别置于平台上(图2)，大鼠可在平台自由活动、饮食。待大鼠进入快速眼球运动睡眠(rapid eye movement sleep,REM)相时，大鼠肌张力下降，头部触水惊醒，强制进行睡眠剥夺。所有大鼠睡眠剥夺72 h。

1.5 分组方法

根据随机数字表, 将所有大鼠随机分成2 组，每组20 只，分别设置为对照组和观察组。

1.6 干预方法

图1 自制睡眠剥夺箱

使用回输专用真空注射器于造模后抽取观察组大鼠尾静脉血2 mL, 与臭氧(40 μg/mL)按1∶1体积比混合3～5 min，随后从尾静脉回输体内，1 次/12 h，共3d。

对照组大鼠使用空气代替臭氧, 其余同观察组。

1.7 观察指标

1.7.1 睡眠时相 分别在干预前及干预结束后, 于9∶00～17∶00, 检测各组大鼠觉醒期(wake, W)、慢波睡眠(slow-wave sleep, SWS)、快波睡眠(fast-wave sleep, FWS)，作为失眠客观评价指标，以评价干预效果。

1.7.2 血清褪黑素水平 分别在干预0 h、24 h、48 h、72 h 时，于凌晨01:00～02:00，抽取大鼠尾静脉血1 mL 进行检查。血液样本保存于4 ℃冰箱，2 500 r/mim 下离心10 min，用试剂盒进行检测。

1.7.3 血清氧化应激指标 分别在干预0 h、72 h时，于凌晨01∶00～02∶00，抽取大鼠尾静脉血1 mL，其余同血清褪黑素水平检测方法。检测试剂购自上海信裕生物工程有限公司

1.8 统计学方法

应用统计软件SPSS 20.0 进行统计分析。血清褪黑素、SOD、GSH-px、MDA 水平均为正态分布计量资料，采用均值±标准差表示。上述指标组间比较采用独立样本t 检验，组内血清褪黑素水平比较采用双因素方差分析，组内SOD、GSH-px、MDA 水平比较采用配对t 检验。P<0.05 为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 两组大鼠睡眠时相比较

干预0 h 时，两组大鼠W、SWS、FWS 比较，差异均无统计学意义(P>0.05); 干预72 h 时，观察组大鼠W 时间短于对照组，SWS、FWS 时间长高于对照组(P<0.05)(表1)。

图2 睡眠剥夺实验

2.2 两组大鼠血清褪黑素水平比较

干预0 h、24 h 时，两组大鼠血清褪黑素水平比较，差异均无统计学意义(P>0.05); 干预48 h、72 h 时，观察组大鼠血清褪黑素水平均高于对照组(P<0.05)(表2)。

2.3 两组大鼠血清氧化应激指标比较

干预0 h 时, 两组大鼠SOD 水平、GSH-px 水平、MDA 水平比较, 差异均无统计学意义(P>0.05);干预72 h 时，观察组大鼠SOD 水平、MDA 水平低于对照组，GSH-px 水平高于对照组(P<0.05)(表3)。

表1 两组大鼠睡眠时相比较 (min)

表2 两组大鼠血清褪黑素水平比较 (ng/L)

表3 两组大鼠血清氧化应激指标比较

3 讨论

失眠症是影响人们身心健康的常见疾病之一。镇静、催眠类药物是治疗失眠症的主要药物，但受副作用和成瘾性影响，临床应用受到限制。臭氧大自血法最早被用于治疗脑梗死，随着研究的深入，其逐渐被应用于治疗包括失眠在内的多种疾病。国内学者王晓平等[10]指出，臭氧大自血法治疗失眠效果优于阿普唑仑，且安全性较好；郭明远等[11]利用臭氧大自血法联合电项针治疗高血压伴失眠症，可有效改善患者睡眠质量，无明显不良反应。然而，目前关于失眠症治疗的研究主要集中在心理水平改变[12]、神经行为学水平改变[13]等方面，对于其机制的研究尚处在起步阶段。近年来，关于失眠机制的可能学说主要集中在下丘脑-垂体-肾上腺(hypothalamic-pituitary-adrenal axis, HPA)轴功能失调[14]、迷走神经张力改变[15]以及褪黑素水平改变[16]等方面。

本研究选取睡眠时相作为观察指标，结果发现，采用臭氧大自血法干预72 h 的观察组大鼠W期短于对照组，SWS、FWS 时间长于对照组。这一结果提示, 臭氧大自血法对于调节睡眠剥夺大鼠睡眠时相具有积极的意义。这与贺丹等[8]、王晓平等[10]的临床研究结果相一致。本研究从动物实验上进一步证实了臭氧大自血法治疗失眠的效果。

由于褪黑素具有镇静催眠和调节睡眠周期的作用，正常情况下，褪黑素受光照调节，光照通过视网膜和视神经将信号转导至松果体，松果体内的色氨酸转变为5-羟色氨酸，5-羟色氨酸逐步转化合成为褪黑素。失眠患者体内褪黑素水平降低，试验性睡眠剥夺模型也具有相似的改变。由此可见，褪黑素不仅是失眠的分子标志物，同时也是失眠的重要诱因之一。由于褪黑素是内源性神经调节剂，其调控受众多因素影响，其在失眠中的具体机制还尚未阐明。有研究证实，褪黑素除了与失眠关系密切外，也在神经功能受损[17]、焦虑抑郁[18]、肝硬化[19]等疾病中发挥着重要的作用，在这些疾病中，褪黑素又与氧化应激反应关系密切。基于以上结果，本研究选取褪黑素和氧化应激指标(SOD、GSH-px、MDA)作为观察指标，探讨臭氧大自血法对睡眠剥夺大鼠血清中上述指标的影响。

本研究结果显示，干预早期(0 h、24 h 时)，两组大鼠血清褪黑素水平差异不显著; 而在干预48 h、72 h 时，观察组大鼠血清褪黑素水平均高于对照组。如前所述，机体褪黑素水平的高低可在一定程度上反映失眠的程度，也是诱发失眠发生的使动因素。因此，有理由认为，臭氧大自血法可阻断失眠发展的诱因，从而对失眠起到治疗作用。随后，本研究观察了两组大鼠SOD、GSH-px、MDA 水平的变化，结果显示，干预0 h 时，两组大鼠SOD、GSH-px、MDA 水平比较，差异不显著; 在干预72 h 时, 观察组大鼠SOD、MDA 水平明显低于对照组，GSH-px 水平明显高于对照组。既往研究认为，机体氧化应激水平的改变参与了失眠的发生发展[20]，针灸及部分药物均可在改善睡眠质量的同时减轻机体氧化应激反应[21-22]。由此可见，氧化应激水平也可能是失眠发展的重要影响因素。

综上所述，臭氧大自血法可促进睡眠剥夺大鼠褪黑素释放，降低大鼠血清SOD 水平、MDA水平，提高大鼠血清GSH-px 水平。但在臭氧干预下的褪黑素与氧化应激水平之间的关系还需进一步探索。