纳米脂质体槲皮素对脑缺血再灌注损伤的神经保护作用及机制

康 瑜, 杨小芳

(四川省遂宁市中心医院神经内科, 遂宁 629000)

槲皮素(quercetin)是酪氨酸激酶特异性抑制剂，在绿色植物中广泛存在，属于黄酮类化合物。近年来研究发现，槲皮素具有清除自由基、抗氧化、抗病毒、抗炎性反应、抗肿瘤等广泛的生物学功能[1-3]。槲皮素对心血管疾病也有较好的治疗效果[4]，并具有抗心肌缺血再灌注损伤的作用[5]。然而槲皮素普通制剂具有难溶于水、靶向性差等特点，限制了其在疾病治疗中的应用。而以纳米脂质体为药物载体包裹槲皮素制成纳米脂质体槲皮素(nanoliposomal quercetin, nLQ)，可以提高槲皮素的生物利用度、靶向性，提高疗效，降低不良反应[6,7]。本研究以槲皮素为原料，采用薄膜蒸发-高压均质法制备nLQ，然后通过腹腔注射作用于局灶性脑缺血再灌注损伤大鼠模型，观察nLQ 对大鼠脑缺血再灌注损伤的保护作用，并对其机制进行探讨。

1 材料与方法

1.1 实验动物

SPF级50 d 龄雄性 SD 大鼠, 体质量260～300 g,由四川中医药科学院实验动物中心提供[SCXK(川)2008-19]，饲养于成都达硕生物科技有限公司实验室[SYXK(川)2019-189]。

1.2 主要试剂及仪器

槲皮素购自成都超人植化公司(HPLC含量≥98%，产品规格20 mg/支，生产批号: 050602);胆固醇购自北京化学试剂公司；磷脂购自德国Lipoid 公司; 红四氮唑(TTC)购自上海钰博生物科技有限公司; TUNEL 细胞凋亡检测试剂盒购自美国Roche 公司; 组织总蛋白提取试剂盒、二辛可宁酸(BCA)蛋白浓度检测试剂盒购自北京索莱宝科技有限公司; 兔抗鼠B 淋巴细胞瘤-2 基因(Bcl-2)、Bcl-2 相关X 蛋白(Bax)及甘油醛-3-磷酸脱氢酶(GAPDH)单克隆抗体购自美国CST公司; 辣根过氧化物标记的羊抗兔IgG购自英国Abcam公司; 肿瘤坏死因子-α(TNF-α)、白细胞介素10(IL-10) ELISA 试剂盒购自晶美生物工程有限公司。AUW120D 型电子分析天平购自日本岛津公司; 探针式超声仪购自美国Branson 公司; 蛋白化学发光凝胶成像系统FluorChem E 购自美国Protein Simple公司; Multiskan MK3 型酶标仪购自芬兰 Thermo Labsystems 公司;显微镜购自美国Thermo 公司。

1.3 nLQ 的制备

采用薄膜蒸发-高压均质法[8]制备。按处方量准确称量槲皮素、胆固醇、卵磷脂、脑磷脂和聚乙二醇-4000，以质量比6∶4∶9∶5∶1 混匀，用氯仿和二甲基亚砜(DMSO)(体积比3∶1)完全溶解。将混匀后的溶液倒入烧瓶中，37 ℃水浴减压旋转蒸发4～8 h。PBS 水化后，置于超声破碎仪中反复破碎，待脂质体槲皮素可通过80 nm滤膜后，即获得nLQ。

1.4 实验分组

80 只大鼠随机分为5 组，每组16 只: 假手术组，模型组，nLQ 低、中、高剂量组。nLQ 质量浓度均为5 mg/mL，采用腹腔注射给药。低、中、高剂量组给药量分别为5 mg/kg、7.5 mg/kg和10 mg/kg, 在造模前7 d及术前1 h分别腹腔注射给药。假手术组及模型组注射等体积生理盐水。

1.5 大鼠局灶性脑缺血/再灌注损伤模型制备

参照Longa 等[9]改良线栓法制备大鼠中动脉栓塞模型: 用7%水合氯醛按5 mL/kg 的剂量腹腔注射麻醉大鼠, 仰卧固定于手术台上, 75%乙醇溶液消毒颈部皮肤, 颈部正中纵行切开皮肤, 分离左侧颈总动脉(CCA)、颈内动脉(ICA)和颈外动脉(ECA)。在ICA 和ECA 分叉处用手术线结扎ECA主干, 用动脉夹暂时阻断CCA和ICA 近心端血流,远心端用一手术线轻轻拉起, 在ECA结扎点近端用1 mL注射器针头刺一小口，将一段头端烧圆的尼龙线插入ICA，至大脑中动脉起始部以完全阻断供血，插入深度约为18 mm, 可感到阻力, 扎紧颈内动脉的手术线，缝合伤口阻断左侧大脑中动脉血流。阻断2 h 后，抽出栓线，进行再灌注。假手术组除不导入线栓，其余操作均同模型组。

1.6 神经功能缺损评分

大鼠在脑缺血 2 h 再灌注 48 h 后，按照5 分制评分标准，对大鼠神经功能缺失症状进行分级评分：可以自由活动，无明显神经功能损伤症状，记为0 分；病灶对侧前爪不能完全伸直，记为1 分；行走时向病灶对侧不自主旋转，记为2分；向病灶对侧倾倒，记为3 分；意识丧失，不能自发活动，记为4 分。评分越高，说明神经功能缺损越严重。

1.7 脑梗塞体积及脑含水量测定

大鼠脑缺血再灌注48 h 后，每组随机选取6 只，用10%水合氯醛麻醉后快速处死取脑，去除小脑、嗅脑及低位脑干，用电子分析天平准确称量脑组织湿重。置于-20 ℃冰箱中冷冻30 min后，将脑组织以2 mm 间距做冠状切片，并立即浸泡在2% TTC 磷酸缓冲液中，37 ℃避光孵育30 min，以质量分数4%的多聚甲醛溶液固定24 h。正常脑组织经染色后为红色，脑梗死组织经染色后为白色，脑切片经拍照采集图像后用Image J 1.37 图像分析软件测量红、白区域体积，计算梗死体积百分比。脑梗死体积百分比=(脑梗死体积/总脑片体积)×100%。

将染色后的脑组织置于120 ℃烤箱中烘干至恒重，记录干重。结合称量的大脑湿重，计算脑组织含水率。脑含水率=(1-脑组织干重/脑组织湿重)×100%。

1.8 ELISA 测定血清TNF-α 和IL-10 含量

大鼠脑缺血再灌注48 h 后，每组选取6 只。用7%水合氯醛麻醉后打开胸腔，用5 mL注射器抽取心脏血2 mL，待常温凝固后，2500 r/min离心15 min。抽取上清液, 采用ELISA 法测定血清中TNF-α和IL-10 含量，按照试剂盒说明书操作步骤进行。用酶标仪测定450 nm 处的吸光度(A)值，通过绘制标准曲线求出样品中TNF-α和IL-10 含量。

1.9 流式细胞术检测脑组织神经细胞凋亡情况

将脑缺血再灌注48 h 后的大鼠用7%水合氯醛麻醉，抽血后分离缺血侧脑组织，用PBS 漂洗去除血细胞，手术剪剪碎后加入1.25 g/L 的胰蛋白酶溶液，于37 ℃消化30 min 左右，然后用200 目细胞筛过滤，滤液经1500 r/min 离心10 min，细胞沉淀用PBS冲洗2次制成单细胞悬液(细胞密度为1×106个/mL)。取1 mL 细胞悬液离心并收集沉淀，PBS 清洗2 次后，加入500 μL 结合缓冲液重悬细胞，然后加入10 μL Annexin Ⅴ-FITC和10 μL碘化丙锭(PI)混匀，室温避光孵育15 min,用流式细胞仪检测细胞凋亡情况。

1.10 Bcl-2 和Bax 蛋白表达水平检测

取大鼠再灌注损伤48 h后的脑组织，剪碎后放置于研钵中，加入液氮充分研磨。按照蛋白提取试剂盒说明书提取组织总蛋白，用BCA试剂盒测定蛋白浓度。取蛋白样品与Loading buffer 充分混合后，100 ℃煮沸5 min 变性。将变性蛋白样品以每孔50 μL 的量加入到SDS-PAGE 凝胶上样孔中，80 V 电压电泳30 min 后，调整电压为120 V 至电泳结束。按照常规方法将蛋白转印至PVDF 膜上，转膜电压为90 V。取出PVDF 膜，经5%脱脂奶粉溶液封闭2 h 后，依次与兔抗鼠Bcl-2、Bax 和GAPDH 单克隆抗体(500 倍稀释)4 ℃孵育过夜，然后与辣根过氧化物标记的羊抗兔IgG(1 000 倍稀释)室温孵育1 h，PBST 洗涤3 次后，滴加电化学发光(ECL)显色液，显影，定影，曝光。用蛋白化学发光凝胶成像系统采集图像，分析蛋白表达水平。

1.11 统计学分析

所有实验数据的统计分析均在SPSS 22.0 统计学软件上进行，结果以x-± s 表示，多组比较用单因素方差分析，两组比较用t 检验，以P<0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 大鼠行为学评分

如表1 所示，模型组大鼠表现出明显的神经功能缺损症状，术后行为学评分显著高于假手术组(P<0.01)，说明造模成功；与模型组比较，nLQ 低剂量组大鼠行为学评分明显降低(P<0.05)，nLQ 中剂量组和nLQ 高剂量组大鼠行为学评分显著降低(P<0.01)。结果说明nLQ 能够显著改善脑缺血再灌注损伤大鼠的神经功能缺损状况，且作用剂量越高，对神经功能的改善效果越好，具有剂量-效应关系。

表1 大鼠脑缺血再灌注后行为学评分Table 1 The behavioral score of rats after cerebral ischemia reperfusion

2.2 大鼠脑梗死体积与脑含水量

如图1 所示，与假手术组相比，模型组大鼠脑梗死体积比与脑含水率均显著升高(P<0.01)。与模型组相比， nLQ 低、中、高剂量组大鼠脑梗死体积比均显著降低(P<0.01)，脑含水率均明显降低(P<0.05)，且具有剂量-效应关系。

2.3 血清中TNF-α 和 IL-10 含量

如图2 所示, 与假手术组相比, 模型组大鼠血清中TNF-α和 IL-10 的含量均显著升高(P<0.01)。与模型组相比，nLQ 低、中、高剂量组大鼠血清中TNF-α和 IL-10 的含量均显著降低(P<0.01)，且具有剂量-效应关系。

2.4 脑组织神经细胞凋亡情况

大鼠脑缺血再灌注48 h 后, 用流式细胞术检测脑组织神经细胞凋亡情况, 并用Western blotting检测凋亡相关蛋白Bcl-2和Bax的表达情况。结果如图3 所示, 与假手术组相比, 模型组大鼠脑组织神经细胞凋亡率显著升高(P<0.01)，Bcl-2 蛋白表达水平显著降低(P<0.01), Bax 蛋白表达水平显著升高(P<0.01)。与模型组相比, nLQ 低、中、高剂量组大鼠脑组织细胞凋亡率均显著降低(P<0.01); nLQ低剂量组Bcl-2 蛋白表达水平明显升高(P<0.05)，Bax 蛋白表达水平明显降低(P<0.05); nLQ 中、高剂量组Bcl-2蛋白表达水平显著升高(P<0.01), Bax蛋白表达水平显著降低(P<0.01)。

图1 大鼠脑缺血再灌注后脑梗死体积与脑含水量测定结果Figure 1 Cerebral infarct volume and brain water content after cerebral ischemia reperfusion in rats

图2 大鼠血清中TNF-α和 IL-10 含量检测结果Figure 2 TNF- α and IL-10 content detected in serum of rats

图3 大鼠脑组织神经细胞凋亡及Bcl-2 和Bax 蛋白表达情况Figure 3 Neuron apoptosis and the expressions of Bcl-2 and Bax proteins in brain tissues of rats

3 讨论

在中国，脑血管疾病居三大死因之首，其中缺血性脑血管病占60%～80%，致死致残率高，严重威胁人类健康。对缺血性脑血管病，目前强调早期溶栓治疗, 以实现血管再通[10], 但由此也会导致缺血再灌注损伤的发生, 加重组织、器官的结构损伤和功能障碍，进而导致患者病情加重[11]。所以，如何保护脑组织和神经细胞免受损伤，抑制缺血梗死区扩大，以及促进神经元结构和功能恢复等，是研究的热点。

槲皮素具有清除体内自由基、抗氧化、抗病毒、抗炎性反应和抗肿瘤等广泛的生物学功能。有研究报道，槲皮素对心肌损伤及脑损伤的保护作用与其抗氧化能力相关[12-13]。并且槲皮素在肝脏疾病治疗中的应用比较多，体内氧自由基堆积是造成肝脏损伤的主要原因，研究显示，槲皮素能够通过抗氧化及清除氧自由基对肝损伤产生保护作用[14]。相关研究也表明，槲皮素安全、无毒副作用[15]。但槲皮素难溶于水，极大地限制了其在体内的吸收。而脂质体是一种新型的药物载体，用其包裹药物能够增加增加药物的水溶性及在体内的循环时间。因此，本实验采用脂质体作为载体包裹槲皮素，并将粒径控制在80 nm 以内，制备nLQ。然后用线栓法构建大鼠局灶性脑缺血再灌注损伤模型，通过腹腔注射不同剂量的nLQ，观察其对脑损伤的保护作用。结果显示，nLQ 能够显著改善脑缺血再灌注损伤大鼠的神经功能, 降低脑梗塞体积和脑水肿程度, 且具有剂量-效应关系。说明nLQ 对大鼠脑缺血再灌注损伤具有良好的神经保护作用。

脑缺血再灌注损伤是多种因素参与的复杂反应，在损伤组织周围也存在着继发性损伤[16]。研究显示，在脑缺血再灌注过程中，炎性反应细胞因子的过量表达起着重要的作用[17-18]。在脑缺血早期阶段，TNF-α分泌增多是脑梗死形成的主要原因，脑缺血再灌注过程中，TNF-α过度表达会导致脑梗死范围扩大，神经功能损伤加重，缺血脑组织血流量减少，进一步加重血脑屏障的损害[19]。因此阻断TNF-α表达可减少缺血性神经元损伤。IL-10 主要由Th2 细胞产生，是很强的抗炎性反应细胞因子，能够抑制促炎性反应细胞因子的过度表达，维持机体内环境的稳定[20]。在脑缺血再灌注损伤过程中，IL-10 可下调炎性反应细胞因子的表达，抑制炎性级联反应的发生，发挥神经保护作用[21]。因此，检测血清或脑组织中TNF-α和IL-10含量对衡量脑损伤程度具有重要意义。本研究结果显示，模型组大鼠血清中TNF-α和IL-10 含量均显著高于假手术组，nLQ 低、中、高剂量组大鼠血清中TNF-α和IL-10 含量均显著低于模型组，且具有剂量-效应关系。以上结果提示nLQ 对大鼠脑缺血再灌注损伤的保护作用可能与其能够降低炎性反应相关。

脑组织神经元细胞凋亡也是造成脑缺血再灌注损伤的重要机制之一[22]，本研究用流式细胞术检测了大鼠脑组织神经细胞凋亡情况，结果显示nLQ 能够降低脑缺血再灌注损伤大鼠脑组织的神经细胞凋亡率，并呈浓度依赖性。细胞凋亡是受多种因素调节的细胞程序性死亡过程。Bcl-2蛋白家族是目前已知的细胞凋亡中最重要的调控因子之一，根据作用不同，分为促凋亡基因和抑凋亡基因两类，其中Bcl-2 可抑制细胞凋亡，Bax 可促进细胞凋亡[23]。研究显示，Bcl-2 和Bax 表达变化与脑缺血再灌注损伤引起的神经细胞凋亡增多相关[24]。本研究结果显示，与模型组相比，nLQ 低、中、高剂量组大鼠脑组织中Bcl-2 蛋白表达水平明显升高，Bax 蛋白表达水平明显降低。提示nLQ 对大鼠脑缺血再灌注损伤的保护作用可能与其能够调控凋亡相关蛋白的表达，进而有效抑制脑组织神经细胞凋亡相关。

综上所述，nLQ 对大鼠局灶性脑缺血再灌注损伤有很好的保护作用，其机制可能与nLQ 能够改善神经功能缺损症状，减少神经细胞凋亡及降低血中炎性反应因子TNF-α和 IL-10 的含量有关。本实验结果为脑缺血再灌注损伤的有效预防及治疗提供了新的思路。