高脂饮食诱导的非酒精性脂肪肝病食蟹猴模型

高仕平, 李 锋, 查思凡

(昆明科灵生物科技有限公司, 昆明 650550)

随着人们饮食习惯的改变, 日常生活中高脂食物摄入量增加，非酒精性脂肪肝病(non-alcoholic fatty liver disease，NAFLD)的发病率逐年上升且呈现低龄化，严重者可导致不同程度的纤维化并逐步演变成肝硬化甚至肝癌[1]。目前，用于NAFLD 的非人灵长类动物模型较少，建立与人类NAFLD疾病相似的动物模型对于NAFLD的发病机制研究、药物治疗和预防控制尤为重要[2-4]。食蟹猴在组织结构、免疫、生理代谢等方面与人类高度近似，是医学研究中理想的实验动物。本试验模拟人类不良的饮食习惯，利用高脂饲料持续饲养正常食蟹猴，导致食蟹猴脂代谢紊乱，加快肝脏脂肪化、纤维化进程，从而诱导NAFLD，分析了高脂饲料饲喂不同时间与丙氨酸氨基转移酶(A L T)、天门冬氨酸氨基转移酶(AST)、甘油三酯(TG)、总胆固醇(TC)、高密度脂蛋白(HDL)、低密度脂蛋白(LDL)、肝脏脂肪化及纤维化的相关性。

1 材料与方法

1.1 实验动物及饲料

700 只普通级健康成年雄性食蟹猴，体质量7～9 kg，7～13 岁，由昆明亚灵生物有限公司提供[SCXK(滇)K2015-0003]。实验在昆明科灵生物科技有限公司动物实验设施中进行[SYXK(滇)K2012-0002]。动物饲养于不锈钢单笼内，室温保持在18～29 ℃，相对湿度保持30%～70%。动物自由进食，自由饮水，光照每日12 h 昼夜循环。实验操作符合昆明科灵生物科技有限公司实验动物伦理委员会的规范要求。

高脂饲料由广州市国龙科技有限公司提供[SCXK(粤)2014-0026], 配方: 15%猪油、30%糖、0.5%胆固醇、5%无营养物质和49.5%基础饲料。

1.2 主要试剂仪器

ALT、AST、TG、TC、HDL 和LDL 试剂盒由罗氏诊断产品(上海)有限公司提供。氟尼辛葡甲胺注射液(外兽药证字14 号)购自法国灵葆雅动物保健品公司，兽用盐酸氯胺酮注射液[兽字药(2015)]购自江苏中牧倍康药业有限公司。

罗氏全自动生化分析仪(c501)，彩色B 超仪(迈瑞M9CV)，半自动活检针(TSK 株式会社，18G)，手动石蜡切片机(RM2235)，光学显微镜(OLYMPUS-BX-51)。

1.3 实验方法

高脂饮食之前对700 只饲喂正常饲料的食蟹猴在空腹12～14 h 后，用盐酸氯胺酮全身麻醉，抽取前肢静脉血液3 mL，肝穿刺进行组织活检，确认动物血液生化指标处于正常范围，肝脏处于健康状态。然后，700 只食蟹猴均饲喂高脂饲料，在饲喂后1 年、2 年、3 年、4 年、5 年、6 年和7 年时，分别抽取34 只、160 只、284 只、81 只、62 只、30 只和49只食蟹猴用于相关检测。

各时间点食蟹猴空腹12～14 h，用盐酸氯胺酮全身麻醉后，抽取前肢静脉采血3 mL，检测血清中ALT、AST、TG、TC、HDL、LDL 指标；在彩色B 超仪的协助下利用半自动活检针对食蟹猴进行肝组织活检，取肝脏右叶于体积分数10%的中性甲醛溶液中固定，脱水、石蜡包埋切片后进行苏木精-伊红(HE)染色和天狼星红染色。光学显微镜下观察肝脏组织病理学变化，判断食蟹猴肝脏是否出现脂肪化和纤维化。每次肝组织活检后, 以2 mg/kg 氟尼辛葡甲胺注射液连续3 d 肌肉内注射止疼。

1.4 数据统计

数据用x- ± s 表示，用SPSS17.0 统计软件分析, P<0.05为差异有统计学意义; 高脂饲料饲喂时间与ALT、AST、TG、TC、HDL、LDL、肝脏脂肪化及纤维化的相关性采用简单相关分析。

2 结果

2.1 高脂饲料饲喂时间与肝脏脂肪化、纤维化发病率

高脂饮食可诱发食蟹猴肝脏发生脂肪变性和纤维化变性，且随着时间延长，发病率总体呈现上升趋势，表明高脂饮食可以推进食蟹猴肝脏脂肪化和纤维化进程(表1)。

2.2 食蟹猴血液生化指标

高脂饮食诱导后食蟹猴各项生化指标与诱导前自身对照，ALT、TG、TC、LDL 在饲喂高脂饲料1 年大部分指标显著上升，随后均维持在较高水平；HDL 先上升后下降，在饲喂7 年时低于实验前(表2)。

2.3 食蟹猴肝组织病理学观察

图1a和图1b为高脂饮食诱导前食蟹猴正常肝脏组织HE染色后镜下20倍和40 倍的图片，肝组织结构正常，肝窦清晰，细胞核位于细胞中央，肝细胞无脂肪变性。之后图片为饲喂高脂饲料后食蟹猴肝脏组织不同程度病理变化。图1c为轻度脂肪肝，少量肝细胞脂肪变性，少量肝细胞肿大变圆呈气球样变，形态不规则，并且伴有炎性细胞浸润(HE); 图1d 为中度脂肪肝，大量肝细胞脂肪变性，肝细胞肿大气球样变更加明显，并伴随明显炎性细胞浸润，肝窦不明显，已可见部分纤维化(HE); 图1e 为重度脂肪肝，几乎所有肝细胞都呈脂肪变性，胞质被大泡型和小泡型脂泡占据，细胞核大量消失，肝窦消失，肝索解(HE);图1f为重度脂肪肝，几乎所有肝细胞都呈脂肪变性，胞质被大泡型和小泡型脂泡占据，细胞核大量消失，肝窦消失，肝索解离，炎性细胞浸润更加明显，纤维化明显(HE); 图1g 为血管周围肝脏细胞脂肪变性，且伴有少量纤维，呈淡红色(天狼星红染色); 图1h 为变性的肝脏脂肪细胞(除血管外)，可见淡红色增粗纤维(天狼星红染色);图1i 为中度纤维化，可见静脉壁周围和窦周周围纤维增粗，且伴有小泡型脂肪变性(天狼星红染色); 图1j 可见静脉周围和窦周纤维明显增粗增多，延伸至肝脏组织其他部位，形成纤维桥，纤维化发生部位常见于静脉及汇管区周围，且伴有大泡型和小泡型脂肪变性(天狼星红染色); 图1k可见汇管区周围细胞胞质被大泡型和小泡型脂泡占据，纤维从汇管区延伸至其他气球样变细胞，纤维增粗，连接成纤维桥(天狼星红染色); 图1l 为重度纤维化，可见纤维从汇管区弥漫至整条肝脏组织，周围肝脏细胞被大泡型脂泡占据，炎性细胞浸润显著, 细胞核变少(天狼星红染色)。

表1 食蟹猴高脂饲喂时间与肝脏脂肪化、纤维化发病率Table 1 High-fat diet feeding time and liver fatty, fibrotic morbidity in cynomolgus monkeys

表2 饲喂高脂饲料食蟹猴生化指标Table 2 The biochemistry indicators of cynomolgus monkey with high-fat diet

图1 高脂饲料饲喂食蟹猴肝组织病理学观察

2.4 高脂饲料饲喂时间与生化指标和肝脂肪化、纤维化相关性

高脂饲料饲喂时间与AL T、AS T、TG、TC、脂肪化、纤维化在0.01 水平(双侧)上显著相关(r 值分别为0.127、0.121、0.246、0.128、0.306、0.220)，与HDL 呈负相关(r=-0.298，P<0.05)，与LDL 在0.05 水平(双侧)上显著相关(r=0.081)。

3 讨论

由于人体各组织器官的复杂性和实验动物的种族差异性，且受动物年龄、性别、当地气候、饲料选择、造模时间限制，以及模型判定指标仍然缺乏相对标准，使任何一种实验动物模型都不能全面、准确地反映脂肪肝的本质，因此，建立一个完全能够反映人类脂肪肝的动物模型比较困难[5]。供选择的实验动物模型的种类很多，但各种造模方法各有其不足，所以应该依据不同的实验来选择相应的实验动物。杨威等[6]给大鼠喂食单纯高脂饲料, 6 周后大鼠表现为典型的NAFLD，呈现显著的肝脏脂肪浸润，但是肝脏纤维化及炎症改变较轻。王昀等[7]使用乙硫氨酸灌胃法，刘峰等[8]使用四氯化碳腹腔注射法，均可以导致小鼠脂质代谢出现障碍，肝细胞形成明显脂滴，但他们建立的小鼠模型与人类的脂肪肝和纤维化发病机制和病程变化存在较大差异， 并且药物毒性强，动物死亡率高。高脂诱导NAFLD的研究水平和层次在不断提高和深入，但其发病机制目前尚不明确。高脂饮食显著增加脂质异常，是高脂血症的主要诱因[9]。Wong 等[10]研究证实，在非肥胖人群中，老龄与 NAFLD 显著肝纤维化的发生率增加呈正相关。而本研究选用中年食蟹猴进行实验，排除了老龄对实验结果的影响。本试验中高脂饲料导致食蟹猴血清T G、TC、LDL-C 含量升高，导致肝脏大量脂质堆积，进而发生脂肪肝；而且随着长期大量脂肪的摄入，肝组织损伤逐渐加重，ALT、AST 活性升高。综合多年以来的研究，NAFLD 是一种多因素作用下产生的疾病，进一步深入研究其发病机制和自然病程，将有助于筛选高危患者。

血脂含量受生活地区、膳食、年龄、性别、职业以及代谢等因素的影响，波动范围较大。血脂异常往往伴随着冠心病、心肌梗死、脑梗死、动脉粥样硬化的发生，导致食蟹猴死亡率上升。血清中TC、HDL、LDL、TG 的含量可在一定程度上反映机体脂肪代谢状况，是监测血脂变化的重要指标；ALT 主要分布在肝细胞质，AST 主要分布在肝细胞质和肝细胞线粒体中，对食蟹猴肝功能的监测具有重要意义。

综上所述，应加大对血脂水平异常偏高人群的健康教育力度，鼓励人们及时监测自己的身体状况，积极发现和治疗疾病，并且注意调整饮食结构，避免高脂饮食，防止和纠正过度肥胖，倡导健康的生活方式。