超声波提取莆田枇杷叶总黄酮及其对酪氨酸酶活性的影响*

傅贤明 许丽兰 郑瑶滨

(莆田学院药学与医学技术学院 福建莆田 351100)

枇杷是莆田四大名果之一，是莆田市的地理标志产品。莆田枇杷种植历史悠久，栽培技术先进，主产区常太镇被誉为“中国枇杷第一乡”[1]。而作为蔷薇科植物枇杷的叶子，枇杷叶是一味常用中药，具有良好的清肺止咳、降逆止呕等作用[2]，收载于历版《中国药典》中。研究发现枇杷叶中含有挥发油、三萜酸、黄酮类化合物、多酚、倍半萜及其糖苷类等成分[2]。其中，黄酮类化合物是枇杷叶的主要有效成分之一，它具有抗病毒、抗肿瘤、降血糖、增强机体免疫功能等作用[3]，在医学和营养学上有较高的应用价值。黄酮类化合物广泛存在于植物界中，人体自身不能合成，而植物药又以其天然、低毒的特点备受关注。因此，近年来从植物中提取黄酮类化合物成为研究的热点，并因此发展出了多种类型的提取方法[4-17]，超声波法便是其中应用较多的一种。超声波可显著加速细胞内有效成分的扩散溶出[18]。超声波提取技术具有提取温度低、提取率高、提取时间短等优点，广泛应用于天然产物有效成分如多糖[19-20]、黄酮[5-6]及生物碱类物质[21-22]的分离提取。

黄酮类化合物的另一个潜在重要作用是可应用于美白化妆品中。黄酮类化合物可作为酪氨酸酶的底物替代剂，替代酪氨酸与酶的结合，使酶失活，从而减少酪氨酸代谢最终产物黑色素的形成而达到美白的效果。目前已有报导绿茄叶黄酮[23]、辣木叶黄酮[24]、荷叶黄酮[25]、柿叶黄酮[26]、桑叶黄酮[27]等相关天然产物黄酮提取物具有对酪氨酸酶活性的抑制作用，而枇杷叶黄酮提取物对酪氨酸酶活性的影响鲜有报导。

莆田是枇杷的重要生产基地，但种植的枇杷主要为采摘果实，枇杷叶是废弃物而未得到有效利用。为更好地开发利用莆田丰富的枇杷叶资源，文章对超声波法提取枇杷叶总黄酮的工艺进行研究，从中筛选出最佳的黄酮提取工艺，同时开展枇杷叶黄酮提取物对酪氨酸酶抑制实验的初步研究，探讨其潜在的美白活性，以期为莆田枇杷叶的深度开发和综合利用提供科学依据。

1 实验部分

1.1 试剂与仪器

枇杷叶，采自莆田市常太镇天马山上，品种为解放钟；芦丁对照品，购自中国药品生物制品检定所；酪氨酸酶，购自Sigma-Aldrich公司；酪氨酸、熊果苷购自上海晶纯生化科技股份有限公司； D101型树脂，购自天津市海光化工有限公司；其他试剂均为分析纯。实验用水为Millipore Milli-Q系统净化的超纯水(18.2 M·cm)。

RHHP-100型手提式小型中药粉碎机(永康市宇茂五金机械制造厂)；BS110S型电子分析天平(德国 Sartorius公司)；UV-2550型紫外可见分光光度计(日本岛津公司)；QL-866型漩涡混匀器(海门市其林贝尔仪器制造有限公司)；KQ5200DE型数控超声波清洗器(昆山市超声仪器有限公司)；HH-4型数显恒温水浴锅(常州智博瑞仪器制造有限公司)。

1.2 实验方法

1.2.1 原料预处理 将枇杷叶用清水冲洗，刷去表面的绒毛，于烘箱中60 ℃烘干，粉碎后过80目筛[3]，粉末置于干燥器中备用。

1.2.2 芦丁标准曲线的绘制 芦丁标准曲线的绘制采用亚硝酸钠-硝酸铝-氢氧化钠比色法[28]。精密称取干燥至恒重的芦丁对照品0.01 g，用60%乙醇配置成0.20 mg/mL的溶液。分别移取上述溶液各0.5、1.0、1.5、2.0、2.5、3.0、3.5、4.0、5.0 mL于试管中，各加5%亚硝酸钠溶液0.3 mL，混匀，放置6 min，再加10%硝酸铝溶液0.3 mL，混匀后静置6 min，再加4%氢氧化钠溶液4.0 mL，最后用60%乙醇溶液补充至10 mL，放置15 min后以试剂空白作为参比扫描紫外可见光谱图。以506 nm处的吸光值为纵坐标，芦丁浓度为横坐标绘制出标准曲线。

1.2.3 枇杷叶总黄酮的提取 精密称取1.00 g枇杷叶粉末于圆底烧瓶中，按实验设计加入一定体积分数的浓度乙醇溶液，在一定温度的恒温水浴下选择一定的超声功率进行超声提取一定时间，实验结束后冷却至室温，抽滤，残渣重复上述操作，合并滤液。将滤液用相应浓度的乙醇溶液定容至一定体积，得到样品溶液。

1.2.4 枇杷叶总黄酮的测定 取样品溶液10 mL置于分液漏斗中用石油醚萃取脱色2次，取0.5 mL经萃取后的溶液，按上述标准曲线的做法(比色法)显色后测定506nm处的吸光值。根据标准曲线方程计算所测样品溶液的浓度，结合稀释倍数和提取液体积，可计算出枇杷叶总黄酮的提取率R(%)，R为每克枇杷叶中总黄酮的得率，以百分比表示。

1.2.5 枇杷叶黄酮提取物对酪氨酸酶抑制率的测定 将按最佳工艺提取的枇杷叶黄酮提取液用石油醚萃取2次，再用D101大孔吸附树脂进行纯化[28]，收集液旋转蒸发浓缩至膏状并干燥成粉末。用此干燥后的枇杷叶黄酮粉末配制成一系列溶液进行酪氨酸酶的抑制活性分析。

按表1所示体积依次准确吸取a、b、c、d四组样液中的L-酪氨酸、PBS缓冲液(pH=6.8)和黄酮提取液于试管中，混匀，37℃水浴恒温10min，然后在b、d管中分别加入0.5 mL酪氨酸酶，恒温反应10min后迅速移入比色皿，测定475nm处的吸光度Aa，Ab，Ac和Ad[29]。枇杷叶黄酮对酪氨酸酶的抑制率计算公式为：抑制率%=[1-(Ad-Ac)/(Ab-Aa)]×100%。Aa：无黄酮提取液无酪氨酸酶时的吸光度；Ab：无黄酮提取液有酪氨酸酶时的吸光度； Ac：有黄酮提取液无酪氨酸酶时的吸光度；Ad：有黄酮提取液有酪氨酸酶时的吸光度。

表1 反应液的组成

2 结果与讨论

2.1 芦丁标准曲线的绘制

亚硝酸钠-硝酸铝-氢氧化钠比色法是目前应用最广泛的总黄酮含量测定方法，该法的原理是在待测物溶液中加入亚硝酸钠-硝酸铝-氢氧化钠试液，通过铝离子与具有邻二酚羟基结构的物质发生络合反应显色来进行测定。芦丁化合物B环上有邻二酚羟基，在碱性条件下与铝离子生成红色金属络合物，该络合物在500 nm左右呈现特征吸收峰[30]。黄酮类化合物也具有邻二酚羟基结构，如果黄酮提取液显色后在同一地方有吸收峰，即可以芦丁作对照品，用比色法进行总黄酮测定。见图1所示。

图1 芦丁溶液、枇杷叶黄酮提取液和空白溶液的紫外扫描图(60%乙醇作为参比)

取芦丁溶液、枇杷叶黄酮提取液、空白溶液(不含芦丁)按照实验部分1.2.2比色法显色后于紫外分光光度计上作全波长扫描。如图1可知，芦丁溶液在506 nm处有一个吸收峰，相应地枇杷叶黄酮提取液显色后在此波长处也有吸收峰，而空白溶液在此处则无吸收。由此可知，该实验可以选择芦丁作为对照，通过比色法来测定枇杷叶中的总黄酮含量。芦丁标准曲线的线性回归方程为A = 12.1109 c + 0.0024，R = 0.9998，该测定方法中芦丁浓度与吸光度具有良好的相关性。

2.2 单因素实验

2.2.1 乙醇浓度对枇杷叶总黄酮提取率的影响 采用枇杷叶粉末质量(g)与乙醇溶液体积(mL)之比为1：20(g/mL)的料液比，恒温60℃，超声功率120W，超声提取时间30 min，改变乙醇浓度，分别选取浓度为30%、40%、50%、60%、70%、80%、90%的乙醇溶液，考察乙醇浓度对总黄酮提取率的影响。每组实验平行测定3次，结果如图2所示。

图2 乙醇浓度对枇杷叶总黄酮提取的影响

由图2可知，开始时总黄酮提取率随乙醇浓度的增大而迅速增加，在50%时出现最大值，之后提取率随乙醇浓度增大逐渐缓慢下降。这是因为不同浓度的乙醇，极性也各不相同，50%乙醇恰好能提取出尽可能多的枇杷叶黄酮。而随着乙醇浓度的增加，过滤后的提取液由棕黄色逐渐变为绿色至墨绿色，说明浓度较大的乙醇溶液可以将一些醇溶性杂质、色素等也同步提取出来[8]，从而使总黄酮提取量降低，不利于黄酮的提取。因此最佳的乙醇浓度确定为50%。

2.2.2料液比对枇杷叶总黄酮提取率的影响 采用乙醇浓度50%，恒温60℃，超声功率120W，超声时间30min，分别选取料液比为1：10、1：20、1：30、1：40，1：50、1：60、1：70，考察料液比对总黄酮提取率的影响。每组实验平行测定3次，结果如图3所示。

图3 料液比对枇杷叶总黄酮提取的影响

随着料液比的增大，总黄酮提取率依次增加，说明料液比越大黄酮在溶液中的溶解也越来越多。当料液比为1：40时，总黄酮的提取率最高。继续增加溶剂的用量，总黄酮含量反而下降，原因在于1：40的料液比已能够将黄酮类化合物最大程度溶出，若继续增大料液比，黄酮类化合物的溶出量变化不大，反而会将其他杂质也溶解出来，影响吸光值，导致提取率下降[7-8]。另外，过大的料液比不但会增加溶剂的用量，而且会增大后续溶剂去除所需的负荷[7]。因此，最佳的料液比确定为1：40。

2.2.3 提取时间对枇杷叶总黄酮提取率的影响 采用乙醇浓度50%，料液比1：40，恒温60 ℃，超声功率120 W，分别选取超声时间为10、20、30、40、50、60min，考察超声提取时间对总黄酮提取率的影响。每组实验平行测定3次，实验结果如图4所示。

图4 提取时间对枇杷叶总黄酮提取的影响

随着超声时间的增加，总黄酮提取率升高，在30 min达到最大值后开始下降。这是因为超声提取时间长短会对黄酮类化合物溶出产生影响。若时间过短，黄酮类化合物还未完全溶出，若时间过长，则一些热敏感黄酮组分有可能会被破坏[7-8]，造成损失。此外，时间过长也会导致溶剂挥发损失，因此，综合各方面考虑，选择最佳的提取时间为30 min。

2.2.4 提取温度对枇杷叶总黄酮提取率的影响 采用乙醇浓度50%，料液比1：40，超声功率120W，超声时间30min，分别选取实验温度为40℃、50℃、60℃、70℃、80℃，考察提取温度对总黄酮提取率的影响。每组实验平行测定3次，实验结果如图5所示。

图5 提取温度对枇杷叶总黄酮提取的影响

由图5可知，总黄酮提取率在60 ℃时达到最大值，当温度继续增加，提取率反而下降。根据分子热扩散原理，分子运动频率随温度的升高而增大，在40～60℃之间，随着温度的升高，黄酮类有效成分的运动频率增加，使其更容易从细胞转移到溶液中，溶解速度加快，总黄酮提取率呈上升趋势[6]。而在60～80℃之间，此时黄酮类化合物已最大程度溶出，但在较高温度下，部分黄酮类化合物可能会发生变化、破坏等[6]，导致黄酮提取率呈下降趋势。因此，最佳提取温度为60℃。

2.2.5 超声功率对枇杷叶总黄酮提取率的影响 采用乙醇浓度50%，料液比1：40，超声时间30min，恒温60℃，分别选取超声功率为80W、100W、120W、140W、160W、180W，考察超声功率对总黄酮提取率的影响。每组实验平行测定3次，实验结果如图6所示。

图6 超声功率对枇杷叶总黄酮提取的影响

由图6可知，随着超声功率的升高，总黄酮含量随之增加，在超声功率140W时，总黄酮提取率达到最大值，而后继续增大超声功率，提取率反而逐渐下降。超声功率的增大会加大细胞的破碎程度，有利于黄酮的溶出，但超声功率过大，会破坏黄酮类化合物，也会使更多的脂溶性物质溶解于提取液中，从而影响总黄酮提取[31]。而且过高的超声功率会增加能量的消耗，加大生产成本，因此选择最佳超声功率为140W。

2.3 正交实验

根据单因素实验结果，固定超声功率140W，选取乙醇浓度(A)、料液比(B)、提取时间(C)和提取温度(D)的三个水平进行4因素3水平(L9(34))正交优化实验，以全面考察这四个因素的正交作用对总黄酮提取的影响。每组实验平行测定3次，取平均值，因素水平见表2，正交实验结果列于表3，方差分析列于表4。

表2 正交试验因素水平表

表3 正交试验设计及结果

表4 方差分析

对正交实验结果进行分析，通过4个因素极差R的比较，表明影响枇杷叶黄酮提取率的因素顺序为乙醇浓度(A)>料液比(B)>提取温度(D)>提取时间(C)。由表4方差分析可知，乙醇浓度对提取率有显著性影响，料液比、提取时间和提取温度对提取率均无显著性影响。因此，提取时应注意严格控制乙醇浓度。根据以上分析，最佳工艺条件为A2 B2 C2 D3，即：超声功率140W，乙醇浓度50%，料液比1：40，提取时间30min，提取温度70℃。

精密称取枇杷叶粉末1.00 g，按最佳提取工艺条件进行实验验证，平行测定6次，取平均值。总黄酮平均含量为10.534%，RSD=1.84%，表明该提取工艺稳定、合理，方案可行。

2.4 枇杷叶黄酮提取物对酪氨酸酶活性的影响

测定不同浓度的经纯化的枇杷叶黄酮提取液对酪氨酸酶活性的影响，结果如图7所示。

图7 枇杷叶黄酮提取物对酪氨酸酶抑制曲线

枇杷叶黄酮提取物对酪氨酸酶表现出明显的抑制作用，且浓度越大，抑制率越强。导致酶活力下降一半所需的黄酮提取液浓度(IC50)为0.43mg/mL，同条件下阳性对照物熊果苷IC50为1.36mg/mL，说明枇杷叶黄酮提取物对酪氨酸酶的抑制作用强于熊果苷。从实验结果也可以初步得出枇杷叶黄酮提取物可作为酪氨酸酶的底物替代剂，替代酪氨酸与酶的结合，阻止酪氨酸氧化，从而减少黑色素的生成，具有潜在的祛斑美白功效，值得进一步研究。

3 结论

超声波提取法相比于传统的回流等提取方法，具有提取速度快、提取效率高、操作简便等优点，近年来已经越来越多地应用到天然产物的提取中。本文采用超声技术提取枇杷叶中的总黄酮，通过单因素实验和正交实验，确定了总黄酮提取的最佳工艺条件为：超声功率140 W，乙醇浓度50%，料液比1：40，提取时间30min，提取温度70℃。在最佳条件下总黄酮的提取率为10.534%，提取率较高。总黄酮提取物经纯化后，其对酪氨酸酶表现出显著的抑制作用，IC50为0.43mg/mL，说明枇杷叶黄酮类化合物可作为酪氨酸酶的底物替代剂，具有潜在的美白活性。莆田具有极为丰富的枇杷叶资源，但枇杷叶并未得到有效的开发利用。文章研究结果有望为从枇杷叶中获取黄酮类化合物并扩展其应用提供实验参考，以此促进莆田枇杷叶的综合利用和深度开发。