青蒿琥酯对痤疮丙酸杆菌的体外抑菌作用及机制研究

陈向明，何 萍，李 婷，张海清，胡 阳

（上海市嘉定区南翔医院皮肤科，上海 201802）

痤疮丙酸杆菌是一种厌氧革兰阳性细菌，被认为是痤疮的主要致病菌[1]，可导致炎症性痤疮和皮肤细胞损伤[2]。由于抗菌药物的过度使用，痤疮丙酸杆菌耐药问题日益严重。青蒿琥酯是青蒿素的衍生物，具有高安全性和良好的药物耐受性。有研究结果显示，青蒿琥酯片与盐酸多西环素治疗酒渣鼻效果相当[3]，而患者对痤疮丙酸杆菌敏感与酒渣鼻的发病机制有关[4]。本研究拟分析青蒿琥酯对痤疮丙酸杆菌体外存活、生长的影响，评估青蒿琥酯与盐酸多西环素联合使用的抑菌效果，并通过扫描电镜进一步观察青蒿琥酯对痤疮丙酸杆菌微观形态的影响，以探索青蒿琥酯用于治疗痤疮的临床意义。

1 材料和方法

1.1 实验菌株

痤疮丙酸杆菌标准株（ATCC 11827）由上海市临床检验中心提供，临床菌株分离自上海市嘉定区南翔医院痤疮患者皮损组织。

1.2 主要仪器与试剂

基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱系统（德国布鲁克-道尔顿公司），S-4800扫描电子显微镜（日本日立公司），比浊仪（法国生物梅里埃公司）。青蒿琥酯（日本化成工业株式会社公司），盐酸多西环素注射液（海南通用康力制药有限公司）、厌氧菌培养肉汤（美国BD公司）、普通和厌氧血琼脂平板（上海伊华科技有限公司），厌氧袋（法国生物梅里埃公司），革兰染色液（美国BD公司）。

1.3 方法

1.3.1 临床株的分离、鉴定与保存 从痤疮患者皮损组织中取分泌物，接种于厌氧血琼脂平板，置厌氧袋内，37℃厌氧培养48 h后，取单个疑似菌落分别接种于普通和厌氧血琼脂平板的同一位置，分别置CO2和厌氧环境中孵育24～48 h。取厌氧菌进行革兰染色镜检，并挑取纯化培养的单个菌落通过基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱系统鉴定细菌。鉴定后的痤疮丙酸杆菌置-80℃保存。

1.3.2 药物最小抑菌浓度（minimum inhibitory concentration，MIC）测定 采用微量肉汤稀释法测定青蒿琥酯和盐酸多西环素对痤疮丙酸杆菌的MIC。将100 μL肉汤加入96孔聚苯乙烯板的每个待测孔，第1列每孔加药物100 μL，然后连续倍比稀释，共稀释11个浓度，青蒿琥酯、盐酸多西环素初始浓度分别为48 mg/mL、2.6 μg/mL，每药1板。加样细菌的浓度为105CFU/mL，加样量为100 μL，37℃厌氧培养48 h后观察培养结果，以不出现浑浊的最低浓度为药物的MIC，每株菌设2个平行试验，同时设阴性对照和阳性对照。

1.3.3 联合药物敏感性试验 采用棋盘式微量稀释法测定青蒿琥酯和盐酸多西环素联合使用的体外抗菌活性，重复测定2次，各药物的起始浓度为对应的MIC的2倍。试验结果以分级抑菌浓度（fractional inhibitory concentration，FIC）指数作为联合药物敏感性试验结果的判断依据。FIC指数≤0.5为协同作用，0.5＜FIC指数≤1为相加作用，1＜FIC指数≤2为无关作用，FIC指数＞2为拮抗作用。FIC指数=（A药联合的MIC/A药单测MIC）+（B药联合的MIC/B药单测MIC）

1.3.4 青蒿琥酯和盐酸多西环素对痤疮丙酸杆菌生长动态的影响 分别观察痤疮丙酸杆菌标准株在青蒿琥酯、盐酸多西环素单独用药与联合用药中的动态生长情况。将含对数生长期的痤疮丙酸杆菌标准株菌液100 μL（浓度为105CFU/mL）接种到100 μL含有相应药物的肉汤中培养，药物终浓度为相应MIC，以不加药物为对照。在培养12、24、48、72 h后分别取培养液10 μL，105倍稀释后，取200 μL稀释菌液涂布于厌氧血琼脂平板上，37℃厌氧培养48 h后计数（CFU/mL）。

1.3.5 电镜观察 将100 μL痤疮丙酸杆菌标准菌液（浓度为105CFU/mL）加到2 mL厌氧培养肉汤中厌氧培养24 h，然后加入青蒿琥酯，使药物浓度为MIC，分别于培养12、24 h后收集培养液，以不加药物的细菌培养液为对照。收集的菌液1000×g离心10 min留取细菌，细菌用2%戊二醛固定2 h后送扫描电镜室试样制备并扫描观察。

1.4 统计学方法

采用SPSS 19.0软件进行统计分析，以P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 菌种鉴定结果

采用基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱系统对临床分离的13株疑似痤疮丙酸杆菌菌株进行鉴定，鉴定结果均为痤疮丙酸杆菌。部分结果见图1。

2.2 形态学变化

扫描电镜观察可见受试菌株经青蒿琥酯作用12 h后，菌体均发生改变，表面出现凹陷。作用24 h后，可见菌体较对照菌体短约1.5～2.0 μm，表面凹凸不平，有凹陷、弯折，对照菌体长4～5 μm，表面光滑、饱满。见图2。

图1 痤疮丙酸杆菌临床分离株质谱鉴定图谱（部分）

图2 扫描电镜观察结果

2.3 体外抑菌试验结果

青蒿琥酯、盐酸多西环素单独用药对痤疮丙酸杆菌的MIC分别为（1.071±0.688）mg/mL、（0.074±0.041）μg/mL，均高于联合用药的MIC[（0.335±0.207）mg/mL、（0.021±0.014）μg/mL]（P＜0.01）。盐酸多西环素和青蒿琥酯联合使用可抑制14株痤疮丙酸杆菌生长，对3株菌呈协同作用，对11株菌呈相加作用。见表1。

2.4 两药单独及联合使用起效时间比较

青蒿琥酯的抑菌特点是缓慢但持续，盐酸多西环素的抑菌特点是快速起效，两药联合使用后，降低了各药浓度，同时综合了两药的特点，可快速、持续地抑菌，抑菌效果优于两药单独使用。见图3。

表1 青蒿琥酯和盐酸多西环素单独用药和联合用药的MIC

图3 青蒿琥酯、盐酸多西环素单用和联合使用的时间-抑菌曲线

3 讨论

青蒿琥酯是全球公认的新型抗疟药物。目前国外对该药的研究主要集中于其抗疟活性，因高安全性和良好的药物耐受性而被关注[5]。近年来的研究发现该药具有抗寄生虫、抗癌、抗病毒和抗过敏的作用。李斌等[6]发现青蒿琥酯与不同抗菌药物有协同抗菌作用。吕品等[7]发现青蒿琥酯对耐甲氧西林金黄色葡萄球菌（methicillin-resistantStaphylococcus aureus，MRSA）有体外抑菌活性，与头孢西丁联合使用可降低MIC。青蒿琥酯对痤疮丙酸杆菌的作用目前尚未见报道。本研究结果显示，青蒿琥酯对痤疮丙酸杆菌的MIC为0.750～3.000 mg/mL，证实了既往青蒿琥酯治疗酒渣鼻的研究推断出的青蒿琥酯对痤疮丙酸杆菌有抑菌作用的结论。

青蒿琥酯的抗疟机制为分子结构中含有的过氧桥结构，在游离铁或者血红素结合铁的介导下，发生断裂，产生自由基，直接作用于疟原虫的膜系结构，导致膜结构的破坏。基于这一机制，蒋为薇[8]发现高浓度的青蒿琥酯对MRSA WHO-2菌的细胞壁有轻微的破坏作用，但在细菌敏感的浓度下对菌膜的破坏作用不明显。本研究扫描电镜观察结果显示，细菌敏感浓度的青蒿琥酯对痤疮丙酸杆菌的细胞壁有轻微的破坏，可能是细菌种类不同造成的。本研究发现，加入青蒿琥酯培养的痤疮丙酸杆菌较未加青蒿琥酯培养的痤疮丙酸杆菌菌体的长度短。SILVA等[9]发现千层香精油作用于单核细胞增生李斯特菌时会使细菌变小，表明细菌在不利生长的环境中可改变菌体大小，与本研究结果一致，提示青蒿琥酯可能具有影响痤疮丙酸杆菌形态的毒性。

本研究结果显示，青蒿琥酯和盐酸多西环素联合作用于14株痤疮丙酸杆菌，其中3株呈协同作用，11株呈相加作用。有研究结果证实由细胞外基质组成的生物膜在痤疮丙酸杆菌的发病机制中起重要作用[10]。与浮游细菌相比，生物膜基质中存在的细菌可增加对常规抗菌药物的耐受性[11]，同时增加消化酶产量[12]。青蒿琥酯已被证实能够降低革兰阳性杆菌铜绿假单胞菌的黏附性，并可破坏成熟生物膜结构[13]。本研究团队后续将对青蒿琥酯是否对痤疮丙酸杆菌生物膜的形成具有抑制作用，对成熟生物膜活性是否有影响，从而增加细菌对抗菌药物的敏感性作进一步研究。

既往研究发现细菌一氧化氮可以对抗药物的杀菌或抑菌作用，青蒿琥酯可结合细菌的一氧化氮合酶（nitric oxide synthase，NOS）的血红素基团灭活NOS，减少地衣芽孢杆菌产生一氧化氮，可逆转一氧化氮介导的抗菌药物的灭活作用，而增强利福平的抗菌作用[14]。有研究发现痤疮丙酸杆菌能够通过活性氧依赖的NF-κB级联反应诱导iNOS、一氧化氮的表达[15]，因此青蒿琥酯与盐酸多西环素对痤疮丙酸杆菌联合作用的效果也值得进一步研究。