IDO/TTS 比值在RA 排除及病情评估中的价值

周福江，伍成斌，高守霞，徐 超，钱文楹，黄秋兰

（上海市嘉定区南翔医院检验科，上海 201802）

目前，类风湿性关节炎（rheumatoid arthritis，RA）的发病机制尚不明确，其治疗方法多采用免疫抑制治疗和抗炎治疗，但仅能延缓病情的发展。吲哚胺2，3双加氧酶（indoleamine 2，3-dioxygenase，IDO）为色氨酸（tryptophan，Trp）代谢中重要的酶，在人和动物的许多组织中均正常表达，但易受细菌、病毒感染带来的致炎因子诱导。当IDO表达升高时，可生成犬尿氨酸（kynurenine，Kyn）等促凋亡因子，抑制免疫细胞的增殖，诱导免疫耐受状态[1]。色胺酰-tRNA合成酶（tryptophanyltRNA-synthetase，TTS ）可拮抗IDO对色氨酸的消耗，通过含色氨酸蛋白的合成而维持细胞的生存和分裂[2]。因此，IDO与TTS可能共同调节细胞内色氨酸的代谢和免疫反应。为此，本研究拟探讨IDO、TTS在RA中的临床价值，以期能为RA的预防和治疗提供参考。

1 材料和方法

1.1 研究对象

选取2017年1月—2018年12月上海市嘉定区南翔医院收治的88例RA患者，其中男46例、女性42例，年龄18～69岁，诊断均符合2010年美国风湿病协会/欧洲抗风湿病联盟制定的RA诊断标准[3]。纳入标准：（1）年龄≥18周岁；（2）脾脏轻度肿大或不肿大。排除标准：（1）合并严重的糖尿病、高血压；（2）合并其他自身免疫性疾病或慢性感染性疾病；（3）采样前1个月内有糖皮质激素或免疫抑制剂治疗史；（4）各项检测指标不完整；（5）患有严重的精神疾病。根据改良疾病活动指数28（disease activity score 28，DAS28）评分[4]将RA患者分为低活动度组（35例，DAS28≤3.2分）、中活动度组（42例，DAS28为＞3.2分～≤5.1分）和高活动度组（11例，DAS28＞5.1分）。参照PREVOO等[5]的方法计算DAS28评分。选取同期上海市嘉定区南翔医院体检健康者88名（正常对照组），其中男50名、女38名，年龄18～65岁。

1.2 样本采集

采用肝素抗凝管和乙二胺四乙酸抗凝管分别采集所有对象静脉血4 mL，以600×g离心10 min，吸取上层血浆，-80℃保存待测。含血细胞的沉淀用于流式细胞术和荧光定量逆转录-聚合酶链反应（reverse transcription-polymerase chain reaction，RT-PCR）检测，24 h内完成检测。

1.3 高效液相色谱法检测血浆Kyn、Trp水平

1.3.1 仪器和试剂 Agilent1100高效液相色谱仪购自美国Agilent公司，乙腈（色谱纯）购自美国天地公司，Kyn和Trp 标准品购自美国Sigma-Aldrich公司（货号分别为K3750、T8941），其余试剂均为国产分析纯。

1.3.2 样本预处理 取400 μL血浆，用400 μL 0.05 mol/L磷酸钾缓冲液（pH值6）对倍稀释，加入2 mol/L三氯乙酸100 μL沉淀蛋白，涡旋混匀1 min，静置10 min，4℃ 15000×g离心10 min，沉淀血浆蛋白，取上清300 μL进样分析。

1.3.3 色谱条件 Agilent Hypersil RP-C18色谱柱（125.0 mm×4.6 mm，5 μm），流动相为0.015 mol/L磷酸钾溶液（pH值6.4）∶乙腈=95∶5（V/V），流速为0.5 mL/min，柱温为25℃；在波长为350 nm的紫外光处检测Kyn水平，在激发波长为284 nm和365 nm处测定Trp水平，计算Kyn/Trp比值。

1.4 流式细胞术检测淋巴细胞内IDO和TTS的表达

1.4.1 仪器和试剂 FACSCalibur流式细胞仪购自美国BD公司。异硫氰酸荧光素（fluorescein isothiocyanate，FITC）标记的小鼠抗人CD45抗体（FITC-CD45）、别藻蓝蛋白（allophycocyanin，APC）标记的小鼠抗人IDO抗体（APC-IDO）、藻红蛋白（phycoerythrin，PE）标记的兔抗人TTS抗体（PE-TTS）、PE标记的驴抗兔IgG抗体（PE-IgG）、APC标记的小鼠IgG1同型对照、APC标记的兔IgG1同型对照、固定/破膜剂（Fixation/Permeabilization Solution Kit）和流式染色缓冲液（Flow Cytometry Staining Buffer）均购自美国BD公司。Ficoll淋巴细胞分离液购自天津市灏洋生物制品科技有限责任公司。

1.4.2 流式细胞术分析 首先建立流式细胞术IDO/TTS检测模板。取肝素抗凝血样本4 mL，分离出外周血单个核细胞（peripheral blood mononuclear cell，PBMC）后，将PBMC浓度调整为1×106个/mL，用吸管吹打混匀至单细胞悬液。取100 μL细胞悬液，加入10 μL FITCCD45，4℃避光染色30 min。用2 mL预冷的染色缓冲液200×g离心洗涤5 min，弃上清，旋涡震荡重悬细胞后加入1 mL 1×固定/破膜剂，再次旋涡震荡混匀，4℃避光放置30 min，再次加入2 mL预冷的染色缓冲液，200×g离心洗涤5 min，弃上清，加入5 μL APC-IDO（1∶100稀释）和10 μL PE-TTS（1∶100稀释），4℃避光染色30 min，加入2 mL预冷的染色缓冲液，200×g离心洗涤5 min，弃上清。在检测管中加入5 μL PEIgG，4℃避光染色30 min，加入2 mL预冷的染色缓冲液，200×g离心洗涤5 min，弃上清，每管中加入200 μL磷酸盐缓冲液后，上机检测。采用CellQuest软件（美国BD公司）分析，调整前向及侧向角，圈出CD45+细胞，定义为淋巴细胞群，从中获取10000个细胞，检测TTS及IDO荧光强度。

1.5 采用荧光定量RT-PCR测定PBMC中IDO mRNA和TTS mRNA的表达

1.5.1 仪器和试剂 LightCycler 480实时荧光定量PCR系统购自瑞士罗氏公司，SYBR PrimeScrip RT-PCR Kit Ⅱ（货号为DRR083S）购自日本TaKaRa公司，Trizol试剂（货号为15596-026）购自美国Invitrogen公司。

1.5.2 荧光定量RT-PCR检测 采用Ficoll淋巴细胞分离液分离PBMC，抽提新鲜分离PBMC中的mRNA，逆转录成互补DNA（complementary DNA，cDNA）。采用荧光定量聚合酶链反应检测IDOmRNA、TTSmRNA的表达，计算IDOmRNA/TTSmRNA比值。（1）引物设计和合成：在Genbank中查找IDO和TTS的mRNA已知序列，并用BLAST软件在Genbank中设计IDO和TTS的特异性引物序列，同时设计内参照基因β-actin的引物序列，引物由美国Invitrogen公司合成，序列见表1。（2）PCR反应条件：95℃5 min；95℃ 15 s，55℃ 15 s，72℃ 35 s，40个循环，温度转换率为20℃/s；扩增循环结束后进行熔点曲线检测（45～90℃，升温速度0.2℃/s，连续检测荧光）。（3）计算相对表达量：扩增结束后，采用配套软件进行检测和分析，采用2-ΔΔCt法计算IDOmRNA和TTSmRNA的相对表达量，并计算IDOmRNA/TTSmRNA比值。

表1 引物序列

1.6 统计学方法

采用SPSS 20.0软件进行统计分析。呈正态分布的数据以表示，组间比较采用t检验，多组间比较采用方差分析。趋势检验采用Cochran Armitage趋势检验（对应的计量资料按总均值转化成两分类资料）。采用受试者工作特征（receiver operating characteristic，ROC）曲线评估IDO/TTS比值在排除RA中的价值和在RA病情评估中的价值。以P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 RA组与正常对照组血浆Kyn、Trp水平和Kyn/Trp比值的比较

RA组血浆Kyn、Trp水平均高于正常对照组（P=0.000），Kyn/Trp比值低于正常对照组（P=0.000）。见表2。

表2 RA组与正常对照组血浆Kyn、Trp水平和Kyn/Trp比值的比较

表2 RA组与正常对照组血浆Kyn、Trp水平和Kyn/Trp比值的比较

2.2 RA组与正常对照组淋巴细胞中IDO、TTS、IDO/TTS比值的比较

RA组淋巴细胞中TTS表达高于正常对照组（P=0.000），IDO和IDO/TTS比值均低于正常对照组（P=0.000）。见表3、图1、图2。

2.3 RA组与正常对照组IDO mRNA、TTS mRNA的相对表达量及IDO mRNA/TTS mRNA比值的比较

RA组TTSmRNA相对表达量高于正常对照组（P=0.000），IDOmRNA相对表达量和IDOmRNA/TTSmRNA比值均低于正常对照组（P=0.000）。见表4。

2.4 不同疾病活动度各组IDO/TTS比值的比较

低活动度组、中活动度组及高活动度组之间IDO/TTS比值依次降低，各组间差异均有统计学意义（P＜0.05）。见表5。

表3 RA组与正常对照组淋巴细胞IDO、TTS、IDO/TTS比值比较

表3 RA组与正常对照组淋巴细胞IDO、TTS、IDO/TTS比值比较

图1 正常对照者淋巴细胞IDO和TTS的表达

图2 RA患者淋巴细胞IDO和TTS的表达

表4 RA组与正常对照组IDO mRNA、TTS mRNA的相对表达量及IDO mRNA/TTS mRNA比值的比较

表4 RA组与正常对照组IDO mRNA、TTS mRNA的相对表达量及IDO mRNA/TTS mRNA比值的比较

表5 不同疾病活动度各组IDO/TTS比值的比较

表5 不同疾病活动度各组IDO/TTS比值的比较

注：趋势检验前将IDO/TTS比值数据按总体均值0.037进行两分类转化，即1≥0.0370=否，趋势检验结果显示差异有统计学意义（Armitage χ2=7.632，P=0.022）

2.5 IDO/TTS比值在排除RA中的价值及对RA病情严重程度的判断价值

以RA组为阳性样本，正常对照组为阴性样本，将IDO/TTS比值数据划分成8个组段，建立排除RA模型的ROC曲线。结果显示，IDO/TTS比值排除RA的曲线下面积（area under curve，AUC）为0.841，最佳临界值为0.080（即IDO/TTS比值＞0.080，可排除RA），敏感性为84.2%，特异性为81.6%，阴性预测值为0.838，阳性预测值为0.821，Youden指数为0.658。见图3。

图3 IDO/TTS比值排除RA的ROC曲线

因RA组中高活动度患者较少，故将病情严重程度分为2组：以高、中活动度患者为严重/阳性样本（53例），以低活动度患者为非严重/阴性样本（35例），将IDO/TTS比值数据划分成8个组段，建立病情评估模型的ROC曲线。结果显示，IDO/TTS比值判断RA病情严重程度的AUC为0.734，最佳临界值为0.042（即IDO/TTS比值＞0.042，RA病情更严重），敏感性为72.1%，特异性为70.7%，阴性预测值为0.626，阳性预测值为0.788，Youden指数为0.428。见图4。

图4 IDO/TTS比值判断RA病情严重程度的ROC曲线

3 讨论

Trp是人体必需的氨基酸，正常状态下成人每天的Trp需求量为3 mg/kg[6]。IDO为含亚铁血红素的单肽链，是Trp沿Kyn代谢的关键酶[7]。健康人体内IDO的表达率较低。当人体内IDO表达率上调和功能增强时，体内Trp代谢加速，生成大量的Kyn，抑制免疫细胞的功能，阻断T淋巴细胞的免疫应答，诱导机体产生免疫耐受[8]。RA为慢性炎症性自身免疫性疾病。有研究结果显示，RA的发生、发展与关节内免疫细胞的活化、聚集有关，可造成免疫调节失衡，进而造成组织、软骨和骨损伤[9]。为此，本研究对IDO/TTS比值在排除RA中的价值及在RA病情评估中的价值进行了探讨，以期能为RA的治疗和病情评估提供参考。

TTS可通过Trp在促进T细胞对抗IDO介导的免疫抑制过程中发挥双重保护作用，一方面可促使更多的Trp用于合成蛋白质，促进细胞增殖[10]；另一方面可抑制IDO介导的代谢作用，降低毒性代谢产物的生成，从而增加RA患者体内反应型T细胞的生成与增殖[11]。Trp经TTS催化结合后，可增加细胞内Trp的储备，调节Trp的代谢过程，进而调控免疫应答[12]。IDO和TTS可参与到Trp的代谢过程中，对多种自身免疫性疾病进行调控，因此Kyn/Trp比值可用于评估IDO活性[13]。本研究结果显示，RA组血浆Kyn、Trp水平均高于正常对照组（P=0.000），Kyn/Trp比值低于正常对照组（P=0.000）；RA组淋巴细胞TTS表达及TTSmRNA相对表达量均高于正常对照组（P=0.000），IDO表达量、IDO/TTS比值、IDOmRNA相对表达量及IDOmRNA/TTSmRNA比值均低于正常对照组（P=0.000）。这可能是由于IDO可促进Trp消耗，抑制细胞免疫，而TTS可与Trp结合而维持细胞免疫，TTS可拮抗IDO对Trp的代谢和消耗，如TTS表达升高可造成Trp代谢失衡，因此IDO和TTS共同参与了体内Trp的代谢，在免疫性疾病中起重要的免疫调节作用[14]。由此可见，外周血淋巴细胞中Trp代谢失调可能与RA的发生、发展有关，自身反应性免疫细胞的激活及对自身组织的持续破坏，最终会导致RA的发生和发展[15]。

本研究ROC曲线分析结果显示，IDO/TTS比值排除RA的最佳临界值为0.080（IDO/TTS比值＞0.080，可排除RA），AUC、敏感性和特异性均高于0.8；判断RA病情严重程度的最佳临界值为0.042，AUC、敏感性和特异性均高于0.7。由此可见，IDO/TTS比值对RA有较好排除价值，对RA病情也有较好的评估价值。

IDO（IDOmRNA）、TTS（TTSmRNA）与IDO/TTS比值（IDOmRNA/TTSmRNA）有直接的换算关系，且IDO、TTS指标较对应的mRNA测定更为简便，因此可以考虑以淋巴细胞的IDO/TTS比值作为RA患者的病情评估指标。IDO是炎症性自身免疫性疾病的致病介质[13]。本研究结果显示，RA患者IDO表达高于正常对照者（P=0.000）。MERLO等[16]的研究结果显示，抗IDO2单抗治疗小鼠RA模型有效。提示抗IDO单抗靶向治疗RA可能是未来RA免疫治疗的潜在策略。

综上所述，RA患者外周血、T细胞内Trp代谢途径失调。IDO/TTS比值对RA有较高的排除价值，亦可用于RA病情的评估。本研究为RA的发病机制研究提供了参考，也为病情评估和寻找新的治疗策略开拓了新的思路。