新型冠状病毒IgM 和IgG 抗体不同检测方法在新型冠状病毒感染中的临床应用评价

郑培明，崔发财，张福明，李 刚

（河南省人民医院 郑州大学人民医院 河南大学人民医院检验科，河南 郑州 450003）

2019年12月以来，湖北省武汉市陆续发现了多例新型冠状病毒肺炎患者，随着疫情的蔓延，我国其他地区及国外也相继发现了此类病例[1]。新型冠状病毒属于β属的冠状病毒，其基因特征与急性呼吸综合征相关冠状病毒（severe acute respiratory syndrome-related coronavirus，SARSr-CoV）和中东呼吸综合症冠状病毒（middle east respiratory syndrome-related coronavirus，MERSr-CoV）有明显区别。有研究结果显示，新型冠状病毒与蝙蝠严重急性呼吸综合征样冠状病毒（bat-SL-CoVZC45）同源性达85%以上[2-3]，国际病毒分类委员会冠状病毒研究小组将其命名为“严重急性呼吸综合征冠状病毒2”（severe acute respiratory syndrome coronavirus 2，SARS-CoV-2），由其引发的疾病被世界卫生组织（World Health Organization，WHO）正式命名为新型冠状病毒肺炎（corona virus disease 2019，COVID-19）。我国国家卫生健康委发布的《新型冠状病毒感染肺炎诊疗方案（试行第七版）》提及的诊断标准中，确诊病例在原有核酸检测和测序基础上增加血清学检测作为依据，即“新型冠状病毒特异性IgM抗体和IgG阳性”或“新型冠状病毒特异性IgG抗体由阴性转为阳性或恢复期较急性期有4倍及以上升高”也可确诊[3]。目前，市场上也已有多种商品化SARS-CoV-2特异性IgM和IgG抗体检测试剂，主要有化学发光法和胶体金法2种快速检测技术。本研究拟采用不同检测方法对25例COVID-19患者进行血清IgM和IgG抗体检测，探讨其在SARS-CoV-2感染诊断中的应用。

1 材料和方法

1.1 研究对象

收集2020年2月以来河南省人民医院确诊的COVID-19患者25例（COVID-19组），其中男12例、女13例，年龄26～90岁，其中重型患者19例，发病天数为15～30 d，平均为23 d，诊断标准符合《新型冠状病毒感染肺炎的诊疗方案（试行第七版）》，核酸检测均为阳性。另选取同期在发热门诊就诊且排除COVID-19的患者20例作为对照组，其中男10例、女10例，年龄24～76岁。

1.2 方法

1.2.1 样本采集 采用含分离胶的真空采血管采集所有对象空腹静脉血5 mL，静置待血液凝固，2500×g离心5 min，分离血清。

1.2.2 胶体金法检测血清SARS-CoV-2抗体 胶体金法采用免疫层析技术原理，使用间接法检测血清SARS-CoV-2 IgM和IgG抗体，试剂盒由广州达瑞科技有限公司生产。检测线与质控线均显色，判定为阳性。

1.2.3 化学发光法检测血清SARS-CoV-2抗体 采用VI-200全自动化学发光免疫分析仪（北京中航赛维生物科技有限公司）及配套试剂（磁微粒化学发光法）检测血清SARS-CoV-2 IgM和IgG抗体，其中IgM抗体采用捕获法检测，IgG抗体采用间接法检测。测定结果以相对发光强度（relative light unit，RLU）表示，样本中的IgM或IgG抗体水平与RLU呈正相关。仪器根据RLU及内置校准曲线自动计算出IgM或IgG抗体水平（AU/mL），以检测结果≥8.0 AU/mL为阳性。

1.2.4 其他项目的检测 采用UPT-3A-1200上转发光免疫分析仪（北京热景生物技术股份有限公司）及配套试剂（双抗体夹心免疫层析法）检测降钙素原（procalcitonin，PCT）水平。采用cobas c501/e601全自动生化免疫分析仪（瑞士罗氏公司）及配套试剂检测C反应蛋白（C-reactive protein，CRP）及铁蛋白，其中CRP用c501模块（散射免疫比浊法）检测，铁蛋白用e601模块（电化学发光法）检测。

2 结果

2.1 胶体金法与化学发光法检测血清SARSCoV-2 IgG抗体的比较

化学发光法和胶体金法检测COVID-19组血清SARS-CoV-2 IgG抗体的阳性率（敏感性）分别为56%（14/25）和76%（19/25）。2种方法联合检测的阳性率（敏感性）为88%（22/25）。化学发光法与胶体金法检测对照组血清SARSCoV-2 IgG抗体均为阴性，特异性均为100%。2种方法检测血清SARS-CoV-2 IgG抗体的总符合率为75.6%（34/45）。见表1。

表1 胶体金法与化学发光法检测血清SARS-CoV-2 IgG抗体的比较 /例

2.2 不同检测方法SARS-CoV-2 IgM抗体检测结果的比较

化学发光法和胶体金法检测COVID-19组血清SARS-CoV-2 IgM抗体的阳性率（敏感性）分别为48%（12/25）和88%（22/25）。2种方法联合检测的阳性率（敏感性）为96%（24/25）。化学发光法与胶体金法检测对照组血清SARSCoV-2 IgM抗体均为阴性，特异性均为100%。2种方法检测血清SARS-CoV-2 IgM抗体的总符合率为68.9%（31/45）。见表2。

表2 胶体金法与化学发光法检测血清SARS-CoV-2 IgM抗体的比较 /例

2.3 COVID-19患者不同检测方法SARS-CoV-2 IgM/IgG抗体阳性率比较

化学发光法和胶体金法检测COVID-19组血清SARS-CoV-2 IgM和IgG抗体双阳性率分别为36%（9/25）和76%（19/25），IgM抗体单阳性率分别为12%（3/25）和12%（3/25），IgG抗体单阳性率分别为20%（5/25）和0%（0/25）。

2.4 COVID-19患者血清炎性指标的变化

25例COVID-19患者中有9例（36%）患者PCT水平升高，最高达10 ng/mL，但大多数患者低于0.5 ng/mL；有18例（72%）CRP水平，最高者超过200 mg/L；有21例（84%）铁蛋白水平升高，最高者超过2000 ng/mL。

3 讨论

随着对SARS-CoV-2感染认识的不断加深，针对该疾病的诊疗方案和诊断标准也在不断地进行着更新和完善。在《新型冠状病毒感染肺炎诊疗方案（试行第七版）》之前的诊疗方案版本中，实时荧光定量聚合酶链反应（polymerase chain reaction，PCR）检测SARSCoV-2核酸阳性或基因测序结果与已知的SARSCoV-2高度同源一直是临床疑似病例的确诊标准。目前，主要采用实时荧光定量PCR检测SARS-CoV-2的核酸。然而，由于受样本采集与存放、病毒感染部位、RNA提取方法及检测试剂盒质量问题等多方面因素的影响，核酸检测阳性患者仅占临床确诊患者的50%左右。此外，实时荧光定量PCR操作繁琐，检测耗时较长，对人员及实验场地等要求较高，不便于在基层医院普遍开展，这些都给SARS-CoV-2感染的诊断及防疫、防控带来巨大的不便[4-5]。当病原体感染人体后，人体免疫系统会对病原体进行免疫防御并产生特异性抗体。因此，使用免疫学相关技术检测患者样本中的特异性抗体也是一种常用的病原体感染快速诊断方法。IgM抗体是初次体液免疫应答中最早出现的抗体，被喻为机体特异性抗感染的“先头部队”，检测IgM抗体可早期诊断感染。IgG抗体产生较晚，但其血清水平较高、维持时间长、亲和力高，因此IgG抗体阳性提示感染处于中后期或既往感染[6-7]。此外，抗体检测对设备无特殊要求，操作简便，在临床诊断的时效性上有极大优势。国家卫生健康委于2020年3月3日发布的《新型冠状病毒感染肺炎诊疗方案（试行第七版）》中已将血清学抗体检测纳入COVID-19的确诊标准中。

目前，国内已经有大批机构进行SARSCoV-2抗体检测试剂的研发和生产，部分厂商已研发出SARS-CoV-2 IgM和IgG抗体检测试剂盒。由于COVID-19为全新的传染病，抗体检测对于SARS-CoV-2感染的诊断来说是一个全新的方法。假阴性和假阳性是任何体外检测手段都无法避免的，因此在临床大规模应用之前有必要对不同抗体检测方法的敏感性和特异性进行充分验证。有研究结果显示，采用化学发光法检测SARS-CoV-2 IgM和IgG抗体有较高的敏感性和特异性，可以作为SARS-CoV-2筛查和诊断的有效手段[8-9]。胶体金法检测SARS-CoV-2 IgM和IgG抗体目前临床报道较少。本研究采用化学发光及胶体金法2种不同的方法对25例COVID-19患者及20例对照者进行SARS-CoV-2 IgM和IgG抗体检测，结果显示，化学发光法检测SARS-CoV-2 IgG和IgM抗体的敏感性分别为56%和48%，低于文献报道[8]，胶体金法检测SARS-CoV-2 IgG和IgM抗体的敏感性分别为76%和88%，检出率相对较高。2种方法的特异性均为100%。抗体检测的敏感性主要取决于抗原抗体的亲和力、检测方法及操作。作为一种针对SARS-CoV-2的新型免疫学检测方法，抗体检测试剂盒基本都是新研发出来的，不同厂商在重组抗原的选择、制备等方面的差异可能会影响重组抗原的抗原性。此外，针对抗体的不同检测方法（双抗原夹心法、间接法、捕获法等）的差异也可能对试剂盒的敏感性、特异性产生影响。本研究使用的磁微粒化学发光法试剂盒分别采用间接法和捕获法检测IgG、IgM抗体，检测体系相对完善，自动化程度较高，从理论上说其敏感性应该较高。造成敏感性较低和假阴性出现的原因可能与重组抗原的制备及包被有关。IgM抗体的检出率低（48%），原因可能是在采用捕获法检测IgM抗体时，酶标记重组抗原影响了抗原与抗体的结合力。2种检测方法的特异性均可达到100%，说明制备的SARS-CoV-2重组抗原特异性好。

《新型冠状病毒感染肺炎诊疗方案（试行第七版）》提及的实验室检查中，多数患者CRP和血沉升高，PCT正常。本研究结果显示，25例COVID-19患者中有36%的患者PCT升高，有72%的患者CRP升高，与《新型冠状病毒感染肺炎诊疗方案（试行第七版）》相符。本研究结果还显示，有84%的患者铁蛋白水平升高，因此铁蛋白或可作为COVID-19的辅助诊断指标。

总之，血清抗体检测方法具有样本采集方便、操作简单快速，可作为SARS-CoV-2核酸检测的有效补充。然而，在临床大规模应用前仍需优化各类检测技术，并进行认真、有效的验证，使质量更加可靠的检测试剂尽早用于COVID-19的临床诊断。由于本研究的样本量较小，因此结论具有一定的局限性。相信随着对SARS-CoV-2研究的深入，相关检测技术和方法会逐渐成熟，SARS-CoV-2 IgM和IgG抗体检测技术将会更多地应用到COVID-19的筛查和诊断中，更好地指导临床诊疗工作。