稻谷黄曲霉毒素的检测与污染控制研究进展

胡振阳 都立辉 袁 康 周 祺

(南京财经大学食品科学与工程学院；江苏省现代粮食流通与安全协同创新中心；江苏高校粮油质量安全控制及深加工重点实验室，南京 210023)

黄曲霉毒素(Aflatoxins, AFT)是一组化学结构类似的化合物，其基本结构为二氢呋喃环香豆素，前者为基本毒性结构单元，后者与致癌因素相关。目前发现的黄曲霉毒素有20余种，主要包括B1、B2、G1、G2、M1、M2等，其中黄曲霉毒素B1(AFB1)的毒性最强[1]。4种黄曲霉毒素(AFB1、AFB2、AFG1和AFG2)均具有高度肝毒性、肾毒性和免疫毒性，各国为避免动物、人类与其暴露接触，全世界对AFT的污染情况进行全面监管[2, 3]。

稻谷是最易受到黄曲霉毒素污染的粮油作物之一。吴芳等[4]测定了中国184个样品中的黄曲霉毒素B1含量，发现贵州、云南、四川、广西、江苏等地黄曲霉毒素B1检出率均在20%以上。有试验[5]对100份大米样品AFB1的污染情况进行评价， 78份糙米样品中的12份样品检测到AFB1，9个城市中有3个城市大米检出AFB1且不合格率约为5%。检测分析我国长江三角洲地区76种粮油产品AFT后发现14.5%的样品被检测到AFB1，4.0%的样品毒素浓度高于我国相应的限量标准[6]。虽然水稻并未立即被定义为一种高风险作物，但就黄曲霉毒素污染水平而言，稻谷及其制品存在地方性低mg/kg的AFB1污染[7]。

1 黄曲霉毒素的分子结构与毒性

黄曲霉毒素是二氢呋喃氧杂萘邻酮的衍生物，20多种结构均为多环芳烃化合物[8]，根据其化学结构将其分为两大类(见表1)：二呋喃香豆素环戊烯酮组：AFB1、AFB2、AFB2a、AFM1、AFM2、AFL、AFQ1)；二呋喃香豆素内酯组：AFG1、AFG2、AFG2a(见图1)。其中，AFM1和AFM2是AFB1和AFB2的代谢产物。AFT是研究最为深入的真菌毒素之一，原因是其对家畜和脆弱的实验动物有致癌和毒理作用，对人类有急慢性肝肿瘤和毒理作用。各种AFT毒性顺序是AFB1>AFM1>AFG1>AFB2>AFM2>AFG2，其中AFB1毒性最强，远远高于氰化物、鹤顶红、三聚氰胺和有机农药，被世界卫生组织认定为1A级危险物[9,10]，表2列出了AFB1对不同动物的半数致死量[11]。

AFB1具有明确的致癌性，导致严重肝损伤甚至肝癌，并对人体造成一系列其他生理损害：1)大剂量下引发急性毒作用甚至死亡；2)慢性亚致死剂量导致人体营养缺乏症以及免疫系统损伤[12]。此外，黄曲霉毒素与其他致病因素对人类疾病的诱发具有叠加效应，据报道称人类摄入AFB1后仅需24周即有致癌的风险，高AFT的饮食暴露接触导致农村人群患肝癌、肠癌等相关疾病的机率高于城市人群。当携带乙肝病毒患者暴露接触AFB1后，患肝癌的风险约为正常人的60倍[10]。因此寻找有效的黄曲霉毒素的检测、降解技术显得尤为重要。文章综述了近年来稻谷黄曲霉毒素的检测与防控技术进展，旨为后续研究提供参考。

表1 黄曲霉毒素分类及结构[8]

表2 AFB1的半数致死量

表3 稻谷制品中黄曲霉毒素的色谱技术检测方法

图1 黄曲霉毒素的结构通式[8]

2 稻谷黄曲霉毒素的分离检测技术

AFT的剧毒性及高致癌性要求必须对稻谷中是否含有AFT进行严格的检测，AFT从20世纪末到21世纪初的定量分析方法取得了长足进展，主要方法有薄层层析法(TLC)、高效液相色谱法(HPLC)、酶联免疫吸附法(ELISA)、免疫层析法(IC)等。

2.1 色谱检测法

近年来，色谱法以其快速、高效、自动化程度高等优点成为稻谷中黄曲霉毒素最常用的分析检测方法。特别是色谱法同时定性定量、灵敏度高、选择性高的优点，大幅度促进稻谷黄曲霉毒素检测手段的发展[13]。表3、表4分别列出了近年来稻谷制品中黄曲霉毒素的色谱技术检测方法和稻谷中AFT分析检测方法比较。

表4 稻谷中AFT分析检测法比较

2.1.1 薄层层析法(TLC)

薄层色谱法在粮油的真菌毒素检测中是一种的传统的检测技术，实验过程耗时烦琐且净化效果不佳，易受杂质干扰，重现性差，属于定性和半定量分析，目前仅作为化学分析中的一般佐证[17]，在稻谷黄曲霉毒素的检测中被逐步淘汰。

2.1.2 液相色谱耦合荧光检测器技术

液相色谱-荧光法因其荧光检测器具有选择性好、灵敏度高、信号强等特点，成为现阶段实验室最常用的AFT分析手段。由于AFB1和AFG1遇水会发生荧光淬灭，因此检测前必须对毒素进行适当的衍生化反应，使其形成稳定的荧光活性衍生物。朱鹏飞等[15]建立了光化学衍生-高效液相色谱法测定粮谷类样品中AFT的方法，该方法中AFB1、AFG1检出限为0.15 ng/g，AFB2、AFG2检出限为0.05 ng/g，加标回收率为89.5%～107%，精密度为1.4%～7.2%，其灵敏度和准确度较高，可适用于粮谷类食品中黄曲霉毒素的检测。Zhou等[16]建立了荧光高效液相色谱免疫亲和柱法测定大米中AFT的方法，对于具有颜色类的大米采用了表面活性剂提高回收率，AFT的回收率在75.2%～94.7%。由于柱前衍生法存在衍生物稳定性差、反应时间长等缺点，李可等[17]对大米样品建立无需衍生化检测手段，该方法的AFT检测限为0.04 μg/L，回收率达到86.8%～96.0%，且实验周期短，操作简单。

2.1.3 液相色谱质谱联用技术

质谱是目前粮食制品中真菌毒素痕量分析检测中使用最广泛且最高效的检测器，液相将质谱作为检测器，黄曲霉毒素的分析检测灵敏度和可靠性大幅提高[13]。Soleimany等[18]研究出一种同时测定谷物黄曲霉毒素的液相色谱串联质谱法，平均回收率83.6%～108.1%，检测限为0.25～0.6 μg/kg，该方法可用于稻谷及其制品中多组分真菌毒素污染物的痕量分析，能一并提供目标毒素化合物的保留时间和分子结构信息，适用于多组分分析，在多毒素同时检测方面显示出广阔的应用前景。

2.2 免疫分析法

2.2.1 酶联免疫吸附测定法(ELISA)

ELISA的优点是反应特异性强、灵敏度高、干扰小、样品预处理简单、检测结果准确且稳定、成本低，现已成为快速检测粮油中黄曲霉毒素最常见方法[26]。Jiang等[27]基于针对AFB1特异性单克隆抗体(MAb3C10)，开发并优化了一种间接竞争性酶联免疫吸附法，该法对稻谷中的AFB1的检测限为0.52 μg/kg，平均回收率为73%～87%，相对标准偏差小于9%，是一种快速、简单、可靠且可同时筛选不同食品基质中AFB1和AFM1的方法。

2.2.2 胶体金免疫层析法(GICT)

王督等[28]研制出一种AFB1胶体金免疫定量检测卡，并建立大米、小麦等粮油产品中AFB1的定量分析方法将GICT与免疫亲和柱净化-HPLC法相比，相对误差<15%，具有简便快速、灵敏度高、重现性好等特点，适用于稻谷及其制品中的AFB1筛查，样品检测时间只需15 min，且检测成本低。为测试胶体金免疫层析试剂的适用性及便捷性，刘坚等[29]使用受AFB1污染的稻谷原始样本，将高效液相色谱法和GICT测定方法进行对照研究，结果表明：两种检测手段的相符率在90.5%以上；而GICT成本低廉、操作简单、快速且准确，可用于现场快速监测和初筛稻谷制品中的AFB1。

2.2.3 时间分辨荧光免疫分析法(TRFIA)

张兆威等[30]利用自行研制的黄曲霉毒素时间分辨荧光免疫层析试纸条进行AFT检测，以稻米等为例进行样品检测，AFB1的检测限为0.3 μg/kg，线性范围为0.8～15 μg/kg，与HPLC法相对误差小于10%的检测结果，说明TRFIA技术与行业标准检测结果具有良好的一致性。TRFIA兼具时间分辨和波长分辨的特点，可有效的减少样本的背景干扰，大幅度提高检测的灵敏度。现今为适应定量、便捷和快速检测的要求，建立了真菌毒素检测的时间分辨多组分分析法，为现场大通量快速筛选食品中的AFT建立一定技术基础。

2.2.4 荧光共振能量转移免疫分析(FRET)

由于FRET兼具均相反应高效、简便、快速的优点，无需额外的洗涤和分离步骤，Sabet等[31]用核酸适配体代替抗体，创新地将免疫学方法与生物传感器技术相结合，开发了一种基于FRET的免疫传感器检测大米中AFB1的含量。该方法纳米生物传感器的检测限为3.4 nm，线性范围10～400 nm，并与AFB2、AFG2和AFM2等干扰物质均未有明显的干扰效应。目前研究将FRET和免疫传感器技术结合，使稻谷中黄曲霉毒素的检测向自动化、高通量和微量化的方向发展。

3 稻谷黄曲霉毒素的防治技术

适当的防治处理是减轻与控制黄曲霉毒素危害的重要手段，主要是指除去、破坏及减少毒素作用的后期处理等。部分降解AFT物化脱毒情况见表5，生物脱毒方法包括微生物吸附和微生物降解等。AFT的部分微生物脱毒情况见表6。据联合国粮农组织规定，AFT的脱毒工艺必须满足以下条件：1)去除AFT或者使其失去活性；2)不产生任何有毒害的副产物；3)破坏产毒真菌孢子或菌丝体；4)食品或饲料脱毒后应保持其原有的适口性和营养价值[32]。

表5 部分降解AFT物化脱毒情况

表6 AFT的微生物脱毒情况

3.1 物理防治

物理防治技术是利用辐射、热、光等物理手段抑制黄曲霉的生长及毒素的合成。其中光技术(如紫外线、脉冲强光、红外辐射和微波辐射)具有无辐射污染、操作简便、无二次污染、食用安全性高等特点，是最具工业化潜力的理想的防控技术。散装贸易中的未加工谷物通常含有灰尘，收获后的第一次稻谷产品加工往往涉及分拣、清洗或碾磨。最初，谷物先通过离心力和气流中的浮选进行批量分选，之后建立起光学分类系统将颗粒流引导到一组光学传感器上，当检测到不同颜色的颗粒时，探测器会触发一个电磁阀，一股压缩空气从气流中排出内核以达到分选的作用，而且这一原理至今仍在使用[33]。农民对谷物进行人工分类以及行业自动分拣，可显著降低黄曲霉毒素的平均含量，此外对谷物铣削、浸泡和挤压等进一步加工，霉菌毒素的含量也进一步降低，而研制大型工业化装置，如物理挑选紫外照射和臭氧去除等装置，以适用于稻谷等粮食行业现场工业化批量，更是一项艰巨的任务与挑战。

3.1.1 微波辅助降解

微波降解是利用微波能量使目标物质分子高速旋转，产生强烈的刺激作用并削弱其化学键直至断裂，从而达到降解目标物的目的[34]。王勇等[35]在微波功率7.5 W/g和处理时间9 min的条件下对中AFB1的降解率达到98.5%，并且试验证明该工艺能确保米蛋白产品安全无毒，还可提高米蛋白的部分品质。但是微波降解不易于大批量处理，同时会使物料不均匀受热，对电能的消耗较大，所以在实际操作中难以规模化生产。

3.1.2 辐射处理

辐射可分为电离辐射(X射线、紫外线、γ射线、电子束)和非电离辐射(微波、红外、无线电波、可见光)，电子束辐射和脉冲强光技术是目前仍在探索黄曲霉毒素降解应用的新技术。

3.1.2.1 脉冲强光

脉冲强光技术降解作用在于其丰富的广谱紫外含量、强烈的短时闪烁、高峰值功率以及调节闪光灯脉冲持续时间和频率输出的能力[36]。Wang等[37]对被脉冲强光处理过含有AFB1、AFB2的稻谷的副产品的毒性和诱变性进行测量，处理稻谷时，辐射通量为84.35 J/cm2的条件下，AFB1和AFB2分别降低75.0%和39.2%，处理米糠时，辐射通量为16.1 J/cm2的条件下，AFB1和AFB2分别降低90.3%和86.7%。但是，如果提高降解效率，在稻谷及其副产品中进行检测，对降解产品进行安全性评价，还需要进一步的研究。

3.1.2.2 伽马射线

Tamikazu等[38]在对稻米加工中产生的黄曲霉毒素的辐照效应进行研究，结果显示：8 kGy可以杀死产毒曲霉菌；精大米中AFB1和AFG1辐射敏感性高于AFB2和AFG2，且辐照所需剂量达到500 kGy时，AFT才能被降解。朱佳廷等[39]采用γ射线(Co60)辐射稻米，4 kGy的辐照剂量下，降解率为42%，当辐照剂量为6 kGy时，降解率可达84%，γ射线辐照表现出对AFB1具有良好的降解效果。

3.1.2.3 电子束辐射(EBI)

电子束辐照技术通过高能脉冲直接破坏生物体细胞中的DNA，或间接辐射小分子和水物质，形成活性自由基，如—OH和—H，并与核内物质反应，产生交联反应[40]。有研究表示EBI对玉米中的黄曲霉毒素具有良好的降解作用，但是作为一种新型技术还未对稻谷及其制品中的黄曲霉毒素表现出降解作用，也没有被证明比伽马辐射在降解AFT方面更有效[41]。

3.2 化学防治

化学防治是使用化学物质(如亚硫酸氢钠、次氯酸钠、柠檬酸等)来减轻或控制真菌毒素的危害。但经化学处理后出现的安全问题更应重视，如降解产物自身仍具有毒性并对稻谷及其制品中风味和营养造成影响等[42]。

3.2.1 传统的化学降解方法

臭氧是一种氧化性高于氯的强氧化剂，在水中有很强的氧化分解能力，可选择性地与化学物质中杂原子发生反应，最终产生小分子物质，可通过破坏AFB1末端呋喃环的双键来降低产物的毒性[43]。周建新等[44]优化了臭氧处理稻谷降解AFB1的工艺条件，对1 000 g稻谷量采用臭氧处理浓度95 mL/m3，时间25 min，AFB1的降解率达到82.0%。Agriopoulou等[45]也相继证实臭氧对AFT降解能力。然而，臭氧使制品营养缺失且不具有成本效益等缺点，致使其在稻谷用于降解黄曲霉毒素的应用有限。

3.2.2 天然精油

植物精油，也称为挥发油，是植物体内一类次生代谢物，常温下易挥发，具有特殊强烈的香味且香味成分穿透力强、持续时间长。植物精油中的某些气相挥发成分具有生物活性，例如肉桂精油由于其内含大量具有挥发性的抗菌成分，因此能有效抑制黄曲霉菌毒素的产生和累积。植物精油来源广泛且天然、生物降解性良好，毒性残留极其微量，将其作为黄曲霉毒素形成抑制剂具有十分良好的应用前景[46]。姜黄精油对真菌生长及AFB1、AFG1的积累有明显的抑制作用，并气相色谱-质谱联用分析表明，其主要成分为异松油烯、异丙基甲苯、α-水芹烯[47]。中国肉桂和月桂精油能够AFB1、AFG1的积累，而芫荽精油不能抑制AFB1的积累[48]。

就目前对植物精油对稻谷中的黄曲霉毒素的积累影响试验研究较少，所以从植物精油寻找和筛选有抑菌作用和使用安全性高的活性成分，同时为防止有毒成分对基质潜在影响造成二次污染，还需不断完善精油及有效成分的毒理学分析和安全性评价，为稻谷及其制品安全食用提供保障[49]。

3.3 生物防治

生物防治是利用微生物在其生长过程的代谢产物或利用微生物自身的特征达到降解毒素的目的。依据生物防治技术原理，主要生物防治方法有：微生物吸附毒素和微生物代谢产物降解毒素，而选择既具有降解能力又不破坏稻谷及其制品品质的酶或微生物是实现生物防治的关键[50]。

3.3.1 微生物吸附毒素

常用微生物吸附剂主要有：酵母菌、乳酸菌、霉菌菌丝体等。Wu等[51]发现AFB1被机体吸收后，代谢途径明显不同，产生无毒的化合物并导致剧毒活性物质的合成，酵母和乳酸菌可作为生物吸附剂阻止其进入人类和动物肠道。同时，AFB1与鼠李糖GG的结合降低黏附Caco-2细胞的能力，也表明细菌可能通过排泄毒素-菌体复合物来减少AFT在肠道中的积累[52]。同时毒素吸附过程是一个受限制的可逆过程，经过反复水洗、过滤、加热等作用会影响毒素-菌体复合物的稳定性，使少量AFM1仍被洗脱下来[53]。有学者称微生物种类、处理条件、环境等因素都会造成毒素-菌体复合物的稳定性降低，加入有机溶剂或重复水洗都会使毒素再次洗脱出来[54]。

微生物吸附和物理吸附一样，将黄曲霉毒素吸附在吸附剂的表面，降低受污染的样品中毒素含量，但并不能从本质上脱除毒素的毒性。所以将基因工程与分子生物学相结合筛选及修饰微生物菌株变得更有必要，以便于应用于稻谷中实际生产。

3.3.2 微生物降解毒素

已从微生物系统中纯化出能够降解黄曲霉毒素的特定酶，特定酶的脱毒作用避免了微生物的缺点，微生物除具有除菌活性外，还会对稻谷风味造成影响并损害其营养价值和可接受性，而生物酶降解方式有着降解效率高、特异性强、不影响营养价值以及安全性高等优势[50]。

Motomura等[55]从平菇中分离纯化了一种新的黄曲霉毒素降解酶，采用19株磨菇菌上清液荧光测定结果表明，其黄曲霉毒素的降解产物尚不清楚，但该酶能裂解AFT内酯环达到降解目的。在大多数情况下，解毒机制仍然不明，例如，Alberts等[56]从平菇、杏鲍菇等食用菌中产生的漆酶与黑曲霉重组对AFB1的降解率达到55%。到目前为止，欧盟还没有授权任何酶来减少食品中霉菌毒素的污染，负责这些活动的酶是否适合工业生产还有待观察。目前的研究表明，相对于物化降解AFT的方法，生物降解法具有安全无毒害、降解效率高、营养损失小等优点，是以后防治AFT的重要研究方向。然而黄曲霉毒素虽能被不同的菌株所降解，但对脱毒物质的分离纯化、降解产物的获得以及毒理学研究相对较少，从培养上清液中去除黄曲霉毒素的新微生物不断被描述出来,但往往缺少后续研究，同时存在菌株脱毒作用周期长、易受环境因素影响等问题。尽管所涉及的酶尚不清楚，但采用菌株进行脱毒防治颇具潜力，与食品加工中使用的所有微生物一样，谷物中用于降低黄曲霉毒素的微生物菌株需要监管机构的批准。对于目前脱毒降解研究存在的问题，笔者就未来可能防治AFT污染技术的研究，提出大致方向：1)微生物中抑菌物质的分离纯化和功能基因序列的获得；2)目前已获得有效降解AFB1的脱毒酶的核酸序列，未来可通过有效的基因修饰手段和高效的分离纯化工艺，利用基因工程的手段实现大规模生产；3)利用分子生物学手段对产毒基因进行改造和修饰培育出不产毒的转基因作物产品实现前期危害控制。

4 结论

黄曲霉毒素污染对人类健康构成严重威胁。现今消费者敏锐地意识到食物对他们健康的重要性，消费者以前对食品安全的看法更偏向于具象型人造的污染物，但天然来源的有毒物质正渐渐受到关注。食品行业已然认识到这一趋势，大力支持毒素降解方面的研究工作。新的物理和化学处理和新的解毒剂(微生物或纯化酶)在经过监管批准上，必须对食品营养成分和感官品质的影响进行风险评估，毒素降解效果与营养物质的损失进行权衡。

黄曲霉毒素的消失不一定意味着完全被降解，若毒素被转化为另外一种被检出的形式，其仍具有毒性。大多情况下，黄曲霉毒素转化的机制未得到充分的了解，产物没有被定性，对毒素降解产物的毒理学研究仅限于体外和急性体内研究，导致此类研究提供的关于慢性低水平接触安全性的信息不足。

现阶段大多数关于霉菌毒素的研究集中在霉菌毒素上，即使是经过充分研究的真菌代谢物也可能引起新的食品安全问题。基因组测序显示，真菌污染食品有可能产生30～60种次生代谢物，其中一些可能会被证明为新的霉菌毒素。一旦评估了新发现的霉菌毒素的毒性和暴露水平，就必须根据新发现的霉菌毒素调整降解方案。同时，笔者在调研时还发现：全球普遍存在AFT与其他类型霉菌毒素(如赭曲霉毒素、呕吐毒素)在稻谷中共存的现象，对黄曲霉毒素的解毒机制和联合毒性作用的研究也将会成为未来科研工作的重要方向。