汉麻籽多肽的氨基酸营养组成与体外结合胆酸盐能力的研究

魏连会 宋淑敏 董 艳 潘 静

(黑龙江省科学院大庆分院1，大庆 163319)

(黑龙江省科学院高技术研究院2，哈尔滨 150028)

汉麻 (CannabissativaL., Hemp)也称火麻、大麻、线麻、黄麻等，是大麻科大麻属一年生草本植物，在我国各地广泛种植，具有悠久的历史[1-2]。中国种植的大麻多为四氢大麻酚(Δ-9-tetrahydrocannabinol, THC)质量分数低于0.3%的工业大麻，为无毒品种[3-4]。

汉麻籽作为油料食品，在我国云南、甘肃等地一直被食用。汉麻籽具有很好的营养价值，含有脂肪酸、蛋白质、碳水化合物、纤维素、维生素、和矿物质[5-6]。其中汉麻籽油中不饱和脂肪酸质量分数在90%以上，ω-6和ω-3的比例接近人体生理代谢的最佳比例。汉麻籽含有20%以上的蛋白质，不含有酶蛋白抑制因子和致敏物。特别是精氨酸含量高于一般的植物蛋白，含有丰富的人体必需氨基酸，是一种完整的植物营养来源[7]，汉麻籽中还含有特殊酚类、甾醇、萜类物质赋予其药学功效[8]。汉麻籽被列入2000版的《中华人民共和国药典》，2001年汉麻籽被列入“药食同源”名单[9]。

汉麻籽在油脂、蛋白方面营养独特，在欧、美、日、韩等发达国家已被开发成功能性食品或保健品，而我国尚处于初加工阶段，有待进行高附加值产品的开发。郭庆启等[10]研究了毛榛榛仁肽的氨基酸营养组成与总还原能力，发现制备出的2种多肽组分，其限制性氨基酸分别为赖氨酸和亮氨酸，通过总还原力评价，证明2种多肽组分均具有抗氧化活性。张文敏等[11]进行了工业亚麻籽粕制备小分子抗氧化肽的研究，通过对亚麻籽粕蛋白的组分分析发现蛋白质氨基酸组成齐全，含有所需的8种必须氨基酸，是一种优质的植物蛋白，所制备的活性肽具有抗氧化活性。目前国内鲜有对汉麻籽多肽氨基酸营养组成评价及其体外结合胆酸盐能力研究的相关报道。

笔者研究团队前期对汉麻籽多肽的制备工艺进行了研究，确定了汉麻籽多肽的最佳制备工艺条件[12]。而本研究通过超滤膜过滤系统对酶解后的水解液进行分离纯化，对得到的汉麻多肽组分，依据氨基酸比值系数和FAO/WHO氨基酸评分标准[13]，进行了相关的营养评价并考察其体外结合胆酸盐能力[14]，以期进一步弄清氨基酸组成和分子质量大小与汉麻籽多肽降血脂活性之间的联系，为汉麻籽高值化加工利用提供参考。

1 材料和方法

1.1 原料和试剂

汉麻籽多肽：黑龙江省科学院大庆分院自制；木瓜蛋白酶(酶活力为 8×105U/g)、中性蛋白酶(酶活力为 1.3×105U/g)；其他化学试剂为分析纯。

1.2 仪器与设备

VFD-6000型真空冷冻干燥机；HA221-50-06型超临界CO2萃取设备；BIOQ-MU1000型切向膜过滤系统；L-8900型氨基酸分析仪。

1.3 实验方法

1.3.1 脱脂汉麻籽粕的制备

用粉碎机将脱壳汉麻籽粉碎后，采用超临界CO2进行脱脂，超临界CO2萃取脱脂的条件为：萃取温度45 ℃、压力30 MPa、萃取时间6.5 h、泵频率18 Hz，将脱脂汉麻籽仁粕在45 ℃条件下烘干，过100目筛后置于封口袋中低温保存。

1.3.2 汉麻籽多肽的制备

称取一定质量的汉麻籽粕，按照1∶5的比例加入蒸馏水溶解，加入3.0%的中性蛋白酶，0.4%的木瓜蛋白酶，酶解pH为5.0，酶解温度为70 ℃，酶解时间为3 h，水浴灭酶，离心分离得汉麻多肽混合液。

1.3.3 汉麻籽多肽的分离纯化

将酶解得到的汉麻多肽混合溶液，通过切向流膜过滤系统，进行分离纯化，采用的过滤膜截留分子质量为(1、3、5 ku)将汉麻籽多肽分成4段不同分子质量的肽段，用真空冷冻干燥机冻干备用。

1.3.4 氨基酸的测定

采用L-8900型氨基酸分析仪检测。参照GB/T 5009.124—2016的方法测定氨基酸，平行测定3次，以平均值作为实验结果。

1.3.5 汉麻籽多肽氨基酸组成的营养评价

汉麻籽多肽的营养评价方法按照1973年世界卫生组织(WHO)和联合国粮农组织(FAO)提出的氨基酸模式[15]，其主要采用以下指数和公式进行计算[16]：

必需氨基酸比值(REAA)=待评蛋白质中某种必需氨基酸含量(mg/g)/(WHO/FAO)模式中相应必需氨基酸的含量(mg/g蛋白)

氨基酸比值系数(RC)=必需氨基酸比值/必需氨基酸比值的均值

氨基酸比值系数分值(SRC)=100-CV×100

式中：CV为RC的变异系数，CV=标准差/均值。

1.3.6 汉麻籽多肽各组分结合胆酸盐能力评价

1.3.6.1 胆酸盐的测定[17]

胆酸盐标准曲线的绘制：分别准确称取胆酸盐 0、20、40、60、80、100、120、140、160、180、200 mg 各置于100 mL 容量瓶中，以蒸馏水溶解并定容。移取不同质量浓度的胆酸盐标准液1 mL于15 mL具塞试管中，加入6 mL 45% 硫酸，混匀，加入 1 mL 0.3% 糠醛，混匀，于65 ℃ 恒温水浴中反应30 min，冷却至室温后，于620 nm 波长处吸光度，绘制标准曲线。

1.3.6.2 汉麻籽多肽对胆酸盐吸附作用的测定

分别配制 6 mg/mL 胆酸钠、脱氧胆酸钠、牛磺胆酸钠溶液，加入4 mg/mL的汉麻籽多肽溶液，于37 ℃恒温水浴锅中反应1 h 后，6 000 r/min 离心分离 20 min。准确移取 1 mL上清液，按照胆酸盐的测定中糠醛显色法测定 620 nm 波长处吸光度，由标准曲线确定其胆酸盐的质量浓度。再根据反应前后溶液中胆酸盐的浓度差计算汉麻籽多肽对胆酸盐的吸附量。

2 结果和讨论

2.1 汉麻籽多肽的分离纯化

采用切向流过滤系统，对酶解汉麻籽多肽的混合液进行分离，实验采用超滤膜(截留分子质量为1、3、5 ku)对混合物进行分离，得到4个不同分子质量的多肽组分，各个组分和分子质量范围如表1所示。

表1 汉麻籽多肽各个组分分子质量分布

2.2 汉麻籽多肽组分的氨基酸组成分析和营养学评价

经氨基酸自动分析仪测定的汉麻籽多肽组分的必需氨基酸组成如表2所示，非必需氨基酸如表3所示，汉麻籽多肽的氨基酸评分如表4所示。

表2 汉麻籽多肽组分的必需氨基酸组成及含量/mg/g

表3 汉麻籽多肽组分的非必需氨基酸组成及含量/mg/g

注:非必需氨基酸含量为每克待测汉麻籽多肽中含有多少毫克的非必需氨基酸。

由表2、表3可知，汉麻籽多肽组分中，谷氨酸质量分数最高，分别为22.32%、21.95%、22.44%、21.69%。精氨酸质量分数次之，分别占14.66%、14.04%、16.59%、13.69%。精氨酸对儿童的生长发育具有重要的作用，因此组分c适合儿童食用，以补充精氨酸。其中各个组分中必需氨基酸质量分数分别为23.83%、24.46%、22.83%、25.19%，其中组分d中的必需氨基酸含量最高，必需氨基酸与非必需氨基酸的比值为0.3367，但低于FAO/WHO规定的标准蛋白质40%和0.6比例。

由表4可知，在汉麻籽多肽的4种组分中，蛋氨酸和胱氨酸评分超过了国际推荐标准，但其他几种必需氨基酸的评分略低，其中组分a、b中缬氨酸、苏氨酸、赖氨酸分别为第一、第二、第三限制性氨基酸；组分c、d中缬氨酸、苏氨酸、异亮氨酸分别为第一、第二、第三限制性氨基酸。

表4 汉麻籽多肽组分的氨基酸评分

现代营养学理论认为，氨基酸不足和过剩都会影响蛋白质的营养价值。因此依据氨基酸平衡理论可以对蛋白质营养价值进行评估。氨基酸比值系数分值SRC越接近100，说明氨基酸在生理功能方面提供的作用越大，其营养价值越高。如果待分析蛋白质中氨基酸与标准氨基酸一致，则各种氨基酸的比值系数RC为1，大于1或小于1，为氨基酸过剩和不足的体现，均为偏离氨基酸模式。对于汉麻籽多肽组分，根据氨基酸的种类和含量，计算出的必需氨基酸比值、氨基酸比值系数和比值系数分如表5所示。

由表5可知，汉麻籽多肽的4种组分中，根据SRC值的大小排列顺序为：组分c>组分a >组分d>组分b。4个多肽组分的第一限制性氨基酸为缬氨酸，组分c的SRC值为48.83，可作为一种较优质的植物蛋白源。

大部分研究发现多肽的氨基酸组成、连接顺序、构型决定特定的多肽功能。4种汉麻籽仁多肽组分中不同组成、不同类别、不同性质的氨基酸组成和含量如表6所示。

表6 汉麻籽多肽组分中不同种类氨基酸的组成分析/mg/g

注：a为甘氨酸、丙氨酸、缬氨酸、亮氨酸、脯氨酸、蛋氨酸、苯丙氨酸、异亮氨酸；b为丝氨酸、苏氨酸、胱氨酸、酪氨酸；c为赖氨酸、精氨酸、组氨酸；d为天门冬氨酸、谷氨酸；e为蛋氨酸；f为苯丙氨酸、酪氨酸。

表5 汉麻籽多肽组分的必需氨基酸比值、氨基酸比值系数及氨基酸比值系数分

2.3 汉麻籽多肽各个组分结合胆酸盐测定

实验选取具有代表性的胆酸钠、脱氧胆酸钠、牛黄胆酸钠，作为研究对象考察不同分子质量的汉麻籽多肽对胆酸盐的结合能力，实验结果如表7所示。

表7 汉麻籽多肽组分对胆酸盐的吸附能力

由表7可知，汉麻籽多肽组分对3类代表性胆酸盐具有吸附作用，其中组分d的吸附能力大于其他3个组分，对胆酸钠吸附率接近90%，对较难被吸附的牛磺胆酸钠的吸附率也高于20%。因此可初步确定组分d 中具有较强降血脂作用的功能因子。实验以胆酸钠、脱氧胆酸钠和牛磺胆酸钠作为吸附对象，揭示了汉麻籽多肽通过吸附胆酸盐，抑制其在肠道的吸收并将其排出体外，从而促进胆固醇在体内代谢转化成胆汁酸的降血脂机理，证实了汉麻籽多肽组分的降血脂作用。

汉麻籽多肽组分d，分子质量小于其他组分，从分子大小角度分析来看，推断水解度对产物的降血脂能力具有一定的影响，即水解度越大，产物的降血脂能力越强，因此为了制备出降血脂能力更强一些的汉麻籽多肽，可以调控反应的水解度，并且选择更适合的酶。

3 结论

通过对酶法制备的汉麻籽多肽组分的氨基酸组成和含量进行分析，汉麻籽仁多肽4个组分的第一限制性氨基酸为缬氨酸，计算出氨基酸的比值系数分别为44.08、39.67、48.83、42.16，表明多肽组分的营养价值一般，但通过结合胆酸盐实验结果表明，4种多肽组分都具有潜在降血脂作用，多肽组分d的潜在降血脂作用最强。