玉米肽-香菇多糖螯合物对小鼠免疫功能的影响

刘 奇 张 智

(东北林业大学林学院，哈尔滨 150040)

玉米肽(Corn peptide，CP)是一种具有特定空间结构和功能活性的短肽聚合物[1，2]。研究表明CP具有抑制血管紧张素转换酶[3，4]、降低血压[5]、促进乙醇代谢、醒酒护肝[6]以及抗氧化[7-10]、缓解疲劳[11]、抗癌[12]等功能。张智[13]等以玉米肽为参照研究玉米肽-锌(CP-Zn)螯合物的结构表征和体内抗氧化活性变化，结果表明CP-Zn的抗氧化活性优于CP，且能显著降低小鼠血清、肝脏中丙二醛含量，提高超氧化物歧化酶的活力。香菇多糖是一种新资源功能活性物质，研究表明香菇多糖具有抗氧化、抗肿瘤[14]提高机体免疫功能等生物活性[15-18]，若能利用香菇多糖结合玉米肽制成具有结构稳定，功能活性较强的玉米肽-香菇多糖螯合物，并将其应用于功能食品的开发中将有广泛发展前景。

因此，本研究利用玉米肽-香菇多糖螯合物(CPG)进行动物实验及细胞实验。以CP及香菇多糖(G)为参照，将健康小鼠分为正常对照组；玉米肽低、中、高剂量组；玉米肽-香菇多糖低、中、高剂量组；香菇多糖低、中、高剂量组，通过小鼠生长性能(体重增长率、免疫器官指数)、体液免疫能力(巨噬细胞增殖能力、巨噬细胞吞噬能力、免疫球蛋白水平)、细胞免疫能力(淋巴细胞增殖能力、淋巴细胞周期)等方面进行分析其免疫功能活性，为CPG的应用及玉米加工副产物综合利用等提供理论基础。

1 材料与方法

1.1 实验材料与试剂

雄性SPF小鼠(20±2)g 6～8 周龄，合格证号SCXK黑2013-004：黑龙江省中医药大学药物评价中心；玉米肽(纯度87.83%)、香菇多糖(纯度89.62%)。

1.1.1 实验试剂

WST-1 细胞培养液，印度墨汁(生物染色剂)，DNFB(优级纯)，Na2CO3(分析纯)，PBS缓冲液，碘化丙啶，RNA 酶，多酚，胰酶，免疫球蛋白IgA、IgG试剂盒。

1.2 仪器与设备

HF-90 CO2恒温培养箱；AE31倒置显微镜；SW-CJ-IF型超净工作台；MEK-7222血细胞分析仪；MULTISKAN MK3型酶标仪；LEICA RM2235石蜡切片机；101-1型电热鼓风恒温干燥箱；BD-326型卧式冷冻冰柜。

1.3 方法

1.3.1 玉米肽-香菇多糖修饰产物的制备

将CP(通过Sephadex G-25分级得到肽段，平均分子质量为572 u，肽质量分数80.01%)配制成底物浓度为4%的溶液，调节pH值至7，取50 mL玉米肽溶液，按投料比为8∶1的比例加入香菇多糖(香菇多糖平均分子质量1 029 D，主要成分为鼠李糖、阿拉伯糖、木糖、甘露糖、葡萄糖和半乳糖等)供体，再次调节pH值至7，60 ℃水浴40 min，冷却后4 500r/min离心10 min；流水透析24 h，冷冻干燥得到最终修饰产物玉米肽-香菇多糖(CPG)[15,19]。经检测，组分中氨基酸总量为70.25%(主要成分为谷氨酸、亮氨酸、脯氨酸、天冬氨酸、丙氨酸、缬氨酸、苯丙氨酸、异亮氨酸等)，玉米肽-香菇多糖螯合率为69.69%，CPG质量分数为60.17%。

1.3.2 动物实验分组及给药

适应性饲养7 d后，称量小鼠体重，将小鼠按照体重指标随机分为10组，每组12只，采用基础饲料饲喂，自由饮水，给药剂量每只0.2 mL，具体给药方法如下表。根据体重差异进行每组每天灌胃给药，连续灌胃给药30 d后处死，每组3次重复。给药剂量根据《保健食品功能学评价程序和检验方法-2003》拟定[19]，动物饲养和处理遵循中国实验动物科学协会实验动物福利和伦理委员会(CALAS)的规定。

表1 功能实验分组

1.3.3 小鼠生长性能的测定

停药后隔日处死小鼠，称取小鼠体重、脾脏、胸腺分别脾脏指数和胸腺指数。

脾脏指数=脾脏(g)/体重(g)×100%

(1)

胸腺指数=胸腺(g)/体重(g)×100%

(2)

1.3.4 小鼠体液免疫能力的测定1.3.4.1 小鼠巨噬细胞增殖能力的测定[20]

末次给药1 h后处死动物，75%酒精浸泡5 min，无菌环境中取出腹腔巨噬细胞悬液，1 000 r/min离心5 min，取细胞沉淀，加4 mL红细胞裂解液吹打均匀，室温静置5 min后，1 000 r/min离心5 min，取沉淀采用4 mL PBS洗涤3遍，重悬中含10%胎牛血清的高糖DMEM培养基中，置于37 ℃、5% CO2培养箱中培养2 h，然后按5×106/孔接种于6孔板进行培养。将处于对数生长期的巨噬细胞按照1×104/孔密度接种于96孔板，按照实验分组进行培养12 h后，采用WST-1法检测细胞增殖，将各组细胞加入20 μL WST-1溶液，置于细胞培养箱内继续孵育2 h后，将96孔板置于摇床上摇动1 min，以充分混匀待检测体系，以酶标仪波长630 nm作为参考波长，在波长450 nm处测定吸光值。

1.3.4.2 小鼠吞噬能力的测定[20]

按每10 g体重0.1 mL的剂量向小鼠尾静脉注射印度墨汁(10 mg/kg)，注射开始时计时，分别在2 min和10 min时取眼血20 μL于3 mL0.1%的Na2CO3溶液中，在600 nm处测定吸光值(OD)，以0.1%的Na2CO3溶液作为空白对照。将小鼠脱臼处死，取肝脏及脾脏并分别称重，按公式计算吞噬指数a。

(3)

式中：a为吞噬指数；m0为小鼠体重/g；m1为小鼠肝重/g；m2为小鼠脾重/g；OD1为2 min时吸光值；OD2为10 min时吸光值。

1.3.4.3 小鼠免疫球蛋白水平的测定

免疫球蛋白测定参照IgA、IgG试剂盒说明。

1.3.5 小鼠细胞免疫能力的测定

1.3.5.1 小鼠淋巴细胞增殖能力的测定

同1.3.4.1操作。

1.3.5.2 小鼠淋巴细胞周期的测定[21]

染色液配制：用0.01 mol/L pH 7.2的PBS缓冲液溶解1.00 mg 碘化丙啶(PI)和1.00 mg RNA 酶，配制成含100 μg/mL PI和100 μg/mL Rnase A的染色液，在-20 ℃下避光保存。

细胞周期检测：无菌条件下取出小鼠脾脏按照细胞常规培养方法，用不同浓度的多酚处理后，用0.25%胰酶消化并将脾脏充分吹打成单个细胞悬液，将细胞收集于1.5 mL无菌离心管中，4 ℃ 以2 000 r/min离心5 min，用PBS缓冲液将细胞洗涤2次，离心5 min后，弃去PBS溶液，加入预冷的75%乙醇2 mL，重悬细胞，放入4 ℃冰箱内固定24 h。

上机前将固定细胞以1 000 r/min的转速离心5 min，弃去固定液，加入pH 7.2的PBS缓冲溶液重悬细胞，离心5 min，弃PBS缓冲液，加入含100μg/mL PI和100 μg/mL Rnase A的染色液，4 ℃避光染色30 min后，使细胞分散后于74 μm筛网过滤，上流式细胞仪检测。

1.3.6 数据处理与分析

采用SPSS软件对数据统计分析，用Excel软件进行绘图处理。

2 结果与分析

2.1 CPG对小鼠生长性能的影响

2.1.1 CPG对体重指数的影响

CP、CPG、G对小鼠体重的影响见图1。与正常组相比，CP-H和CPG-M、CPG-H均能显著提高小鼠体重水平。这表明CPG和CP均能提高小鼠的体重增长率，但CP需要在高剂量的水平下才能达到显著效果。

注：不同字母表示差异显著P<0.05，下同。图1 CP、CPG、G对小鼠体重的影响

2.1.2 CPG对免疫器官指数的影响

胸腺是重要的中枢免疫器官，其主要功能是产生T淋巴细胞和分泌胸腺素，参与细胞免疫；脾脏是外周免疫器官，具有丰富的淋巴细胞和巨噬细胞，但B淋巴细胞比例较大，与体液免疫关系更为密切，因此胸腺、脾脏是机体重要的免疫器官，而其脏器指数可在一定程度上反映机体免疫功能的强弱。由图2可知，与空白组相比，CP-M、CP-H和CPG-L、CPG-M、CPG-H、G-M、G-H组均能显著(P<0.05)提高免疫器官指数，且CPG较CP组的效果更加明显。CP、CPG、G均能显著提高小鼠的生长性能指数，且CPG较CP组效果更加显著。

图2 CP、CPG、G对小鼠免疫器官指数的影响

2.2 CPG对小鼠体液免疫的影响

2.2.1 CPG对小鼠巨噬细胞增殖能力的影响

CP、CPG、G对小鼠巨噬细胞增殖能力的影响见图3。细胞增殖指细胞经过DNA复制、RNA转录和蛋白质合成等反应而进行的分裂过程，是生命体的重要特征。RAW264.7 细胞作为巨噬细胞的一种，当病原体入侵或自身组织出现病理性改变时，它能激活机体的免疫系统，通过细胞内杀伤作用消灭抗原[20]。由图3可知，与正常组相比，CP-M、CP-H和CPG-L、CPG-M、CPG-H，G-M、G-H均能显著(P<0.05)提高小鼠巨噬细胞的增殖能力，且CPG的效果要优于CP和G。

图3 CP、CPG、G对小鼠巨噬细胞增殖能力的影响

2.2.2 CPG对小鼠吞噬能力的影响

CP、CPG、G对小鼠吞噬能力的影响见图4。吞噬能力指巨噬细胞通过吞噬侵入的病原体及体内衰老、畸变的细胞而提高机体的免疫能力。在小鼠碳廓清实验中，体内碳颗粒被清除的速率与血碳浓度呈指数关系，且动物的脾脏、肝影响机体的吞噬速率，其吞噬能力的大小可以间接反映机体巨噬细胞的吞噬能力，可以在一定程度上体现出机体的非特异性体液免疫水平[22]。由图4可知，与正常组相比，CP-M、CP-H和CPG-L、CPG-M、CPG-H、G-H剂量组均能显著(P<0.05)提高小鼠的吞噬能力，且CPG的效果要优于CP和G-H。这表明CP、CPG、G均能显著提高小鼠巨噬细胞的增殖能力和吞噬能力，且和剂量呈现正相关，从而发挥提高机体体液免疫的生物学功能。

图4 CP、CPG、G对小鼠吞噬指数的影响

2.2.3 CPG对小鼠免疫球蛋白水平的影响

CP、CPG、G对小鼠免疫球蛋白水平的影响见图5。免疫球蛋白是指具有抗体活性或化学结构上与抗体相似的球蛋白，一般存在于血液及某些细胞的表面上，血清免疫球蛋白的测定是检查体液免疫功能最常用的方法。IgG是血清主要的抗体成分，约占血清Ig的75%，其主要在机体免疫中起保护作用[23]。IgA分血清型和分泌型两种，血清型IgA可介导调理吞噬ADCC作用；分泌型IgA(SIgA)是机体粘膜防御系统的主要成分，它能抑制微生物在呼吸道上皮附着，减缓病毒繁殖，是防止病原体入侵机体的第一道防线。由图5可知，与正常组相比，CP-H和CPG-L、CPG-M、CPG-H显著(P<0.05)提高机体免疫球蛋白IgA水平；CP-M、CP-H和CPG-L、CPG-M、CPG-H、G-H均能显著(P<0.05)提高机体免疫球蛋白IgG。

图5 CP、CPG、G对小鼠体液免疫功能的影响

2.3 CPG对小鼠细胞免疫的影响

2.3.1 CPG对小鼠淋巴细胞增殖能力的影响

CP、CPG、G对小鼠淋巴细胞增殖能力的影响见图6。T淋巴细胞在机体细胞免疫系统中发挥着关键作用，当外界应激源和肿瘤细胞抗原接触T细胞时，会刺激T细胞增殖、分化成效应T细胞，产生细胞免疫和抗肿瘤反应[24]，因此，淋巴细胞增殖实验是反映机体免疫状态的一种实验。由图6可知，与正常组相比，CP-H和CPG-M、CPG-H、G-H能显著(P<0.05)提高小鼠巨噬细胞的增殖能力。这表明CP、CPG、G都能促进机体的淋巴细胞增殖能力进而达到提高机体细胞免疫水平。

图6 CP、CPG、G对小鼠淋巴细胞增殖能力的影响

2.3.2 CPG对小鼠淋巴细胞周期的影响

CP、CPG、G对小鼠淋巴细胞周期的影响见图7。淋巴细胞增殖是机体发挥细胞免疫的重要途径，当淋巴细胞与抗原或有丝分裂因子(简称为丝裂原)在体外共同培养转化为淋巴母细胞，并且分裂增殖生成更多的淋巴细胞进行发挥细胞免疫[25]。结合前期实验发现，CP-H和CPG-H、G-H高剂量组具有最佳的生物活性能，因此，此处主要采用流式细胞仪检测空白对照组、CP-H高剂量组与CPG-H和G-H的脾淋巴细胞分布情况。识别DNA损伤的关键是G1、S期和G2/M等周期检查点。由图7可知，空白对照组、CP-H剂量组与CPG-H、G-H剂量组的G0/G1期比例分别为92.42%、88.47%、87.88%、89.56%；S期比例分别为2.77%、4.13%、4.41%、3.31%；G2/M比例分别为3.18%、7.99%、9.70%、4.98%。CP-H剂量组、CPG-H、G-H剂量组与空白对照组相比G1分别减少了3.95%、4.54%、2.48%；S期分别增加了1.36%、1.64%、1.15%，这说明CPG较CP、G更能促进细胞从G1期向S期转化，有利于DNA的合成，提高小鼠脾淋巴细胞增殖分化能力。

图7 流式细胞术检测脾淋巴细胞周期分布

3 结论

利用玉米肽-香菇多糖螯合物(CPG)进行小鼠体内及细胞实验，结果表明：CP、CPG、G能显著提高小鼠生长性能，且CPG组较CP和G组能显著提高免疫器官指数，对免疫器官发育的促进作用要优于CP；CP高剂量组、CPG低中高剂量组、G高剂量组均能显著(P<0.05)提高小鼠体液免疫能力，增强小鼠巨噬细胞的增殖能力、吞噬能力，提高免疫球蛋白IgA和IgG水平，这表明CPG对机体体液免疫能力的提升作用要优于CP和G；小鼠细胞免疫能力方面，CP和CPG均能促进小鼠淋巴细胞增殖能力，且CPG较CP更能促进有丝分裂，不影响阻滞细胞，促进细胞从G1期向S期转化，有利于DNA的合成，提高小鼠脾淋巴细胞增殖分化能力。研究表明CPG对机体的免疫增强效果要优于CP，其可以通过促进小鼠机体生长性能、体液免疫能力水平、细胞免疫能力水平发挥其免疫生物学活性。