生物除磷工艺中高效聚磷菌的快速筛选和鉴定

张华 ，马涛 ，李丽 ，黄健

(1.安徽建筑大学环境与能源工程学院，安徽 合肥 230601；2.水污染控制与废水资源化安徽省重点实验室，安徽 合肥 230601)

0 引言

污水生物除磷工艺中，聚磷菌通过厌氧环境下释磷，好氧环境下过量吸磷将水中的磷元素转移至聚磷菌胞内，最终以排除剩余污泥的形式实现磷的去除。因此，聚磷菌在混合菌中所占比例高低直接决定着生物除磷的效果[1]。目前通常采用厌氧/好氧交替运行法实现对污水生物除磷工艺中聚磷菌的富集，然而混合菌中高效聚磷菌的比例有待提高[2]。而采用传统平板筛选法进行聚磷菌筛选时工作量大，效率低，且针对性较差[3-4]。因此，高效聚磷菌的快速筛选和准确鉴定有助于提高生物除磷的效率，有利于聚磷菌除磷机理和生理特性的深入研究[5]。

该试验采用序批式活性污泥反应器首先富集聚磷菌，再采用厌氧/好氧交替平板迭代培养法初步粗筛聚磷菌菌株，并根据聚磷菌能够利用代谢产生的半乳糖甘酶分解5-溴-4-氯-3-吲哚基-磷酸盐(BCIP)产生蓝绿色 5-溴-4-氯靛兰的功能[6]，采用BCIP蓝白斑筛选法快速分离聚磷菌。再将分离后的聚磷菌采用厌氧PHB染色法及好氧异染颗粒染色法进一步进行判断，最后通过高通量测序技术鉴定其类别。该研究为生物除磷过程中高效聚磷菌的筛选和鉴定及聚磷菌生理特性及功能的深入研究提供基础支持。

1 材料和方法

1.1 试验装置和运行周期

该试验采用序批式活性污泥反应器对聚磷菌进行富集培养，反应器容积为15 L，反应器运行每天4个周期，进水30 min，厌氧60 min，好氧180 min，沉淀45 min，排水10 min后静置35 min。每周期进水和出水量均为4.5 L，各周期进水，搅拌，反应，出水等操作均采用微电脑时控开关进行自动启停控制。

1.2 接种污泥和试验用水

该试验接种污泥取自合肥市某污水处理厂氧化沟。进水采用人工配水，其中COD浓度为180.4 mg/L，正磷酸盐浓度为12.3 mg/L，总氮浓度为8.3 mg/L。

1.3 试验方法

1.3.1 分析检测方法

正磷酸盐检测采用分光光度法，COD检测采用重铬酸钾法，总氮检测采用碱性过硫酸钾消解紫外分光光度法。PHB染色法运用苏丹黑等染色液对厌氧阶段PHB进行染色，异染颗粒染色法运用甲苯胺蓝和孔雀绿等混合溶液对好氧阶段异染颗粒进行染色[7-8]。

1.3.2 聚磷菌的筛选

序批式活性污泥反应器稳定运行后，用150 mL无菌锥形瓶取好氧末端的活性污泥，加入适当玻璃珠震荡破碎后逐级稀释倍数为 10-1，10-2，10-3，10-4，10-5的5种不同浓度梯度的菌悬液。将厌氧固体培养基[9]于 121℃灭菌20 min，冷却到 55～60℃后倒入培养皿，冷却待用。将制备的菌悬液吸取400 μL涂布于厌氧培养基上，37℃于厌氧培养箱中培养24 h。采用接种针挑取的方法把在厌氧培养基中生长迅速的菌落接种至好氧固体培养基[10]上，于37℃恒温培养24 h。待菌落长好后采用相同方法接种至厌氧培养基中，重复6～7次。挑取生长迅速的菌落接种于涂布100 μL的BCIP显色剂的培养基培养，将生长迅速的蓝绿色菌落作为研究对象，最终将厌氧阶段的菌种进行PHB染色，好氧阶段进行异染颗粒染色，在LB培养基上进行划线纯化和保存。

1.3.3 菌株除磷性能测试

取用LB培养基保存的冷藏菌种，吸取该菌种混合液20 μL到LB固体培养基进行划线涂布，在37℃好氧培养24 h后，用接种针挑取单菌落与0.3 mL无菌水混匀后，取100 μL混合液用涂布棒涂布接种于LB固体培养基的平板上，在37℃条件下培养24 h后，用孔径为0.5 cm的打孔器取2个孔的菌种(包括培养基)到含15 mL LB液体培养基的无菌离心管中，于37℃、130 r/min的恒温摇床中培养24 h后作为种子液。再将种子液接入到含有100 mL配水液体培养基的250 mL的锥形瓶中(种子液体积/合成污水液体培养基体积比为8%)，再放到温度为37℃，转速是120 r/min的摇床中培养18 h，使得锥形瓶中含有一定的菌种数量。再经厌氧摇床培养0.5 h，使菌种这个阶段充分吸收小分子有机物并释放磷，再次开启摇床曝气培养1 h后，取悬浊液于离心管中，12000 r/min转速下离心5 min，取上清液进行磷指标检测。

1.3.4 菌株生物学鉴定

将菌株委托通用生物(安徽)有限公司进行16S rDNA稳定区测序，在BCBI Genbank中使用Blast程序进行序列比对和同源性分析，最后采用MEGA10.0软件中的最大似然估计法构建样本菌株与相似菌株系统发育树鉴定出各菌株的菌属。

2 结果与讨论

2.1 序批式活性污泥反应器工艺除磷效果分析

序批式活性污泥反应器运行结果如图1所示。由图1可知，反应器运行稳定后，当进水磷浓度约为12.3 mg/L时，出水中磷约为0.2 mg/L，除磷率在95%以上，说明通过序批式活性污泥反应器实现了聚磷菌的富集。

图1 序批式活性污泥反应器运行结果

2.2 聚磷菌BCIP蓝白斑筛选及染色分析结果

采用BCIP蓝白斑筛选法对厌氧/好氧反复交替培养后的菌株进行筛选，筛选结果如图2所示。由图2可知，经过BCIP蓝白斑筛选后，共得到4株能够分解BCIP呈现蓝绿色的聚磷菌。

图2 BCIP蓝白斑筛选结果

对厌氧阶段PHB和好氧阶段异染颗粒进行染色，结果如图3所示。染色图片均在100倍的OLYMPUS BX51电子显微镜下实现。由图3可知，将4株菌种进行厌氧PHB，好氧异染颗粒染色，PHB颗粒和异染颗粒均呈蓝黑色。

2.3 菌株除磷测试结果

对4株菌株进行除磷性能测试，测试结果如表1所示。由表1可知，4菌株的除磷率均在85%以上，说明筛选出来的4株菌的除磷效率均较高。研究表明，除磷率在80%以上是聚磷菌的显著特征[11]。

表1 各菌株的除磷效果

2.4 菌株DNA序列鉴定结果

图3 菌株PHB和异染颗粒染色结果

对4株菌株进行相关菌系统发育树分析结果如图4所示。由图4可知，1号菌株序列与Exigu-obacterium sp.ZWU0009(微小杆菌属)的16S rDNA相似度最高，相似度为91%，2号菌株序列与Bacillus sp.C10(芽孢杆菌属)的16S rDNA相似度最高，相似度为90%，3号菌株序列与Exiguobacteriumacetylicum strain BGSLP4(乙酰杆菌属)的16S rDNA相似度最高，相似度为99%，4号菌株序列与 Exiguobacteriumacetylicum strain SI17(乙酰杆菌属)的16S rDNA相似度最高，相似度为99%。一般认为，相似度在80%以上可明显体现样本间的相似度[12]。该研究中4株菌株的相似度均在90%以上，说明4株菌株的鉴定结果可靠。

图4 菌株与相关菌的系统发育树

3 结论

运用厌氧/好氧交替平板迭代培养并综合BCIP蓝白斑筛选、厌氧PHB染色、好氧异染颗粒染色法可以快速准确的筛选出高效聚磷菌，所筛选出的4株高效聚磷菌除磷率分别为1号菌85.51%、2号菌 91.06%、3号菌 95.51%、4号菌89.13%。高通量测序对4株高效聚磷菌进行了鉴定，鉴定结果表明，1号菌为Exiguobacterium sp.ZWU0009(微小杆菌属)、2号菌为Bacillus sp.C10(芽孢杆菌属)、3号菌为 Exiguobacteriumacetylicum strain SI17(乙酰杆菌属)、4号菌为Exiguobacteriumacetylicum strain BGSLP4(乙酰杆菌属)。