流感双解方抑制甲型H1N1流感病毒的体外实验研究

周雅萍 李国春 关晓伟

[摘要] 目的 分析流感双解方抑制甲型H1N1流感病毒的体外实验。 方法 24只新西兰白兔随机分为三组，每组8只。分别给予流感双解方、利巴韦林、生理盐水灌胃并制含药血清，分析药物抑制甲型H1N1流感病毒效果。 结果 甲型H1N1流感病毒鼠肺适应株A/PR8/34（H1N1）TCID50为10-4.575/100 μL。流感双解方与利巴韦林含药血清最大细胞无毒浓度分别为40%与50%。预防感染、直接杀活与复制增殖抑制实验均显示，病毒感染组OD值低于细胞组（P < 0.05），利巴韦林组和流感双解方组OD值均高于病毒感染组（P < 0.05）;利巴韦林组和流感双解方组病毒抑制率比较，差异无统计学意义（P > 0.05）。 结论 流感双解方具有体外预防、直接杀灭和感染后抑制甲型H1N1流感病毒作用。

[关键词] 流感双解方;甲型H1N1流感病毒;抗病毒;利巴韦林

[中图分类号] R285.5          [文献标识码] A          [文章编号] 1673-7210（2020）04（c）-0028-04

Study on inhibition of influenza A virus by influenza Shuangjie Decoction in vitro experimental

ZHOU Yaping   LI Guochun   GUAN Xiaowei

School of Medicine & Holistic Integrative Medicine， Nanjing University of Chinese Medicine， Jiangsu Province， Nanjing   210023， China

[Abstract] Objective To analysis inhibition of influenza A virus by influenza Shuangjiefang Decoction in vitro experimental. Methods Twenty-four New Zealand white rabbits were random divided into three groups， eight per group. Influenza Shuangjiefang Decoction， Ribavirin， and normal saline were given by gavage and drug-containing serum was prepared to analyze the effect of drugs on inhibiting influenza A virus. Results The influenza A virus rat lung adaptation strain A/PR8/34 （H1N1） TCID50 was 10-4.575/100 μL. The maximum non-toxic concentration of influenza Shuangjiefang Decoction and Ribavirin-containing serum were 40% and 50%， respectively. The experiments prevent infection， direct inactivation and replication proliferation inhibition showed that the OD value of the virus infection group was lower than that of the cell group （P < 0.05）; the OD value of the ribavirin group and the influenza Shuangjiefang Decoction group were higher than that of the virus infection group （P < 0.05）. There was no statistically significant difference in virus inhibition rate between the ribavirin group and the influenza Shuangjiefang Decoction group （P > 0.05）. Conclusion Influenza Shuangjiefang Decoction has the functions of in vitro prevention， direct killing and inhibition of influenza A virus after infection.

[Key words] Influenza Shuangjie Decoction; Influenza A virus; Antiviral; Ribavirin

流感病毒（IFV）是具有囊膜、多节段的单股负链RNA病毒，属于正黏病毒科[1]。根据抗原性差异和基因特性差异，主要存在甲、乙、丙3种类型的病毒，而流行病学上最容易发生的是甲型流感病毒[2-3]。流感雙解方是国医大师周仲瑛所拟抗呼吸道病毒方，临床研究显示其能有效促进肺炎吸收和流感病毒抗原转阴[4-5]。本实验主要分析流感双解方对甲型H1N1流感的预防、直接杀灭与抑制作用。

1 材料与方法

1.1 仪器与试剂

犬肾上皮细胞株（MDCK）、甲型流感病毒鼠肺适应株A/PR8/34（H1N1），均由江苏省疾病预防控制中心提供。

DMEM培养基（上海博湖生物科技有限公司）;四甲基偶氮唑盐（上海联硕生物科技有限公司）;新生牛血清（南京全隆生物技术有限公司）;胰酶（上海中西三维药业有限公司）。96孔微孔混匀仪（QB-8001，海门市其林贝尔仪器制造有限公司）;CO2培养箱（JYWD8698，北京金洋万达科技有限公司）;台式冷冻离心机（5810R型，Eppendorf公司）;酶联免疫检测仪（HBS-1096B，上海贺琛能源科技有限公司）。

1.2 实驗动物

选择南京中医药大学医学院动物中心的SPF级健康雄性新西兰白兔24只，体质量2.0～2.5 kg，平均（2.2±1.2）kg。饲养条件：湿度7%～10%，温度25℃左右，每日光照12 h，予以普通兔饲料、饮用级纯净水常规饲养，保持环境清洁卫生与通风。本研究经南京中医药大学医学院动物伦理委员会批准。

1.3 实验药物

流感双解方（南京中医药大学百草堂），根据实验动物临床用药剂量原则[6-7]，浓缩至浓度为0.908 g/mL;利巴韦林颗粒（山东立强药业股份有限公司），稀释药物浓度为0.456 mg/mL;均置于4℃冰箱保存[8]。

1.4 方法

1.4.1 含药血清的制备  24只白兔于实验室饲养3 d后，随机分为三组，每组8只。第4～6天进行不同方式的灌胃处理，2次/d。其中空白血清组给予50 mL生理盐水，流感双解方组灌胃量36.32 mg/（kg·d），利巴韦林组18.24 mg/（kg·d）。第6天给药完毕1 h后，进行颈动脉采血，务必保证白兔是在清醒的状态下，采集的标本静置3 h后，3000 r/min（离心半径15 cm）离心15 min后取上清液，56℃水浴灭活30 min，过滤后分组保存，保持-20℃。

1.4.2 细胞病变（CPE）法测定病毒对MDCK细胞的半数感染量（TCID50）  MDCK细胞以1×105个/mL细胞浓度接种，100 μL/孔，置37℃、5%CO2培养箱（余下实验培养箱温湿度条件相同）培养，甲型流感病毒鼠肺适应株A/PR8/34（H1N1）病毒悬液用维持液10倍稀释（10-1～10-8）8个浓度。待发现MDCK细胞为单层时，吸弃培养液，再进行磷酸盐缓冲液（PBS）清洗，接种不同浓度的H1N1病毒悬液，100 μL/孔，并使其均匀吸附，吸弃病毒液后每孔加入含2%小牛血清维持液100 μL继续培养，即时观察病变。正常细胞对照孔则加入100 μL维持液;以最高稀释度不再出现新病变时为终点，观察出现细胞病变效应（CPE）的孔数，无病变为（-），≤25%细胞病变为（+），>25%～50%为（++），>50%～75%为（+++），>75%为（++++）。根据Reed-Muench法[9]计算TCID50：距离比=（高于50%百分数-50%）/（高于50%百分数-低于50%百分数），TCID50=距离比+高于50%病变病毒最高稀释度的对数。

1.4.3 MTT法测药物最大无毒浓度  MDCK细胞以1×105个/mL细胞浓度接种，长成单层后，分别加入不同浓度（10%～100%）的流感双解方、利巴韦林含药血清，并设正常细胞对照组。培养24 h，每孔加入MTT（5 mg/mL）20 μL，使其均匀吸附，培养4 h，吸弃上清液，每孔加入150 μL DMSO，测定各孔光密度值（OD值），计算各药物的最大无毒浓度。上述三组均以每组8只新西兰白兔的血清标本按1～8标签逐次实验，取其均值分析。细胞存活率=加药组OD值/对照组OD值×100%。以细胞存活率≥90%作为药物最大无毒浓度。

1.5 观察指标

1.5.1 药物对病毒感染的预防作用  0.25%胰酶消化单层MDCK细胞，以1×105个/mL的细胞浓度接种培养。待细胞长满所需密度（80%～90%）时吸去培养液，PBS洗两遍。分为细胞组、病毒组、利巴韦林组和流感双解方组，每组8份，按血清标本1～8标签逐次加入药物血清。药物组加入相应药物，细胞对照组与病毒组加入细胞维持液。培养24 h后，吸去培养液，PBS洗两遍。除细胞组加维持液外，其他三组细胞均用100 TCID50/100 μL IFV感染;逐日在倒置显微镜下观察，直至发现病毒感染组细胞CPE达（++++）时加入预先过滤除菌5 mg/mL的MTT溶液20 μL/孔，继续培养4 h;吸去上清液，加入DMSO溶液150 μL/孔，测定OD值。通过公式计算药物对病毒的抑制率：病毒抑制率（%）=（药物组平均OD值-病毒感染组平均OD值）/（细胞对照组平均OD值-病毒感染组平均OD值）×100%。观察药物对病毒的预防作用。

1.5.2 药物对病毒感染的直接灭活作用  分别将流感双解方血清、利巴韦林血清与等体积的100 TCID50流感病毒在无菌EP管中混匀，置培养箱里培养，按照“1.5.1”方法进行MDCK细胞的培养及分组。除病毒组应用100 TCID50/100 μL IFV感染外，其余组均加入维持液100 μL;经培养箱吸附、PBS清洗等操作后，三组分别加入利巴韦林血清和病毒混合液、流感双解方血清和病毒混合液、细胞维持液，100 μL/孔，继续培养4 h;余下步骤同“1.5.1”。观察药物对病毒的直接灭活作用。

1.5.3 药物对病毒吸附后复制增殖的抑制作用  按照“1.5.1”方法进行MDCK细胞的培养、分组，用100 TCID50/100 μL IFV感染各组细胞（细胞组不感染，加维持液100 μL）;进行培养箱吸附、PBS清洗等操作后，分别加入利巴韦林血清、流感双解方血清、细胞维持液，100 μL/孔，培养4 h;余下实验步骤同“1.5.1”。观察药物对病毒吸附后复制增殖的抑制作用。

1.6 统计学方法

选择SPSS 20.0软件对所得数据进行统计分析，计量资料以均数±标准差（x±s）表示，采用t检验。以P < 0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 IFV干预MDCK细胞出现细胞病变效应情况

MDCK细胞中流感病毒H1N1亚型TCID50为10-4.575/100 μL。IFV干预MDCK细胞出现细胞病变效应情况见表1。

表1   IFV干预MDCK细胞出現细胞病变效应情况

注：IFV：流感病毒;CPE：细胞病变效应

2.2 不同浓度含药血清对MDCK细胞存活率的影响

正常对照组细胞存活率为100%，流感双解方组与利巴韦林组不同浓度含药血清的MDCK细胞存活率比较，差异无统计学意义（P > 0.05）。见表2。流感双解方与利巴韦林含药血清最大细胞无毒浓度分别为40%（0.363 g/mL）、50%（0.228 mg/mL）。

表2   不同浓度含药血清对MDCK细胞存活率的影响（%，x±s，n = 8）

注：正常对照组细胞存活率为100%

2.3 四组预防感染、直接灭活及复制增殖抑制OD值比较

病毒感染组预防感染、直接灭活及复制增殖抑制的OD值明显低于细胞对照组（P < 0.05）;利巴韦林组和流感双解方组OD值均高于病毒感染组（P < 0.05）;利巴韦林组与流感双解方组间OD值比较，差异无统计学意义（P > 0.05）。见表3。

表3   四组预防感染、直接灭活及复制增殖抑制OD值比较

（x±s，n = 8）

注：与细胞对照组比较，△P < 0.05;与病毒感染组比较，*P < 0.05

2.4 两组预防感染、直接灭活及复制增殖抑制病毒抑制率比较

两组预防感染、直接灭活、复制增殖抑制的病毒抑制率比较，差异无统计学意义（P > 0.05）。见表4。

表4   两组预防感染、直接灭活及复制增殖抑制病毒抑制率比较

（%，x±s，n = 8）

3 讨论

中药抑制甲型H1N1流感病毒取得不错疗效[10-13]。周仲瑛教授针对流感病毒遵循“气营两清、表里双解、祛邪外达”的原则，流感双解方是其防治外感热病的临证经验方，具有清气泻热、凉营解毒等功效[14-16]。为此，本研究以新西兰白兔为实验对象，分析了流感双解方对甲型H1N1流感病毒的抑制作用及应用价值。

实验中，甲型流感病毒鼠肺适应株A/PR8/34（H1N1 TCID50为10-4.575/100 μL。分别筛选出浓度40%（0.363 g/mL）的流感双解方、50%（0.228 mg/mL）的利巴韦林含药血清为最大细胞无毒浓度。在含药血清浓度超过上述值时，会发生明显的细胞病变，出现细胞皱缩、细胞间隙变大、胞质不透明、粗糙、部分细胞脱落等现象[17]。因此认为，将≤0.363 g/mL的流感双解方用于甲型流感病毒感染的新西兰白兔体外实验时，细胞存活率>90%。

进一步实验显示，IFV感染MDCK细胞后，药物对H1N1亚型流感病毒预防感染、直接灭活及病毒吸附后复制增殖抑制的OD值较病毒感染组均有明显升高。OD值作为被检测物吸收掉的光密度值，通过检测OD值能够了解药物对MDCK细胞活性的保护作用。OD值越高，提示活细胞数量越多、细胞活性越佳[18]。本研究显示，流感双解方用于H1N1亚型流感病毒预防感染、直接灭活及吸附后复制增殖抑制时，均能获得较好的干预效果，细胞活性率佳;流感双解方组所检测OD值与利巴韦林组比较，差异无统计学意义（P > 0.05），提示流感双解方应用于H1N1亚型流感病毒治疗中时能获得与利巴韦林相似的效果。在两种药物的病毒抑制率比较中，无论是药物对流感病毒预防感染的抑制率，还是对直接灭活和病毒吸附后复制增殖抑制的抑制率，流感双解方组与利巴韦林组比较，差异无统计学意义（P > 0.05），这进一步肯定流感双解方用于H1N1亚型流感病毒治疗中的理想效果。

H1N1亚型流感具有起病急、传变快等特点，早期表现为邪由表入里，里热渐起，继而传营入里。因此，在治疗上需遵循“表里双解、汗和清下”的辨证治疗思路[19-20]。流感双解方作为治疗外感热病的经验方，能通过多途径、多靶点灭活流感病毒，抑制病毒吸附与增殖，从而充分发挥对H1N1亚型流感病毒感染的治疗作用。其主要由金银花、连翘、北柴胡、荆芥、酒大黄、生石膏、知母、黄芩、淡竹叶、芦根等十余味中草药所组成[21-22]，诸药合用，共奏疗效，对减轻炎性病变、抑制细胞凋亡有良好作用。

综上，流感双解方在H1N1亚型流感病毒感染的预防、直接灭活和复制增殖抑制方面均有较为理想的抑制作用。本研究可为中医药抑制流感病毒的临床应用提供科学依据，能在一定程度上促进中医药诊治重大疾病的转化应用。

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（收稿日期：2019-10-25  本文编辑：王晓晔）