miR-501靶向BLID介导吉非替尼耐药性非小细胞肺癌的恶性表型

葛凌 陈何健 徐航娣

[摘要] 目的 探究miR-501在吉非替尼耐药非小细胞肺癌（NSCLC）中的作用和机制。 方法 采用实时定量聚合酶链式反应（qRT-PCR）检测吉非替尼耐药性NSCLC血清和细胞系PC9/GR中miR-501的表達水平，通过CCK-8、划痕实验和Transwell实验检测miR-501对PC9/GR的恶性表型的影响;利用在线数据库预测miR-501的潜在靶点，并验证其在PC9/GR的具体作用。 结果 与健康对照人群和正常人肺上皮细胞系比较，miR-501在吉非替尼耐药性NSCLC患者血清和PC9/GR中表达水平升高，差异有高度统计学意义（P < 0.01）;与mimics NC比较，miR-501 mimics PC9/GR的增殖、迁移和侵袭能力增加，差异有高度统计学意义（P < 0.01）;荧光素酶报告基因实验证实BLID是miR-501的直接靶点;与miR-501 mimics+pcDNA3.1比较，miR-501 mimics+pcDNA3.1-BLID PC9/GR的增殖、迁移和侵袭能力下降，差异有高度统计学意义（P < 0.01）。 结论 上调表达的miR-501通过抑制BLID进而促进吉非替尼耐药性NSCLC的增殖、迁移和侵袭能力。因此，miR-501是吉非替尼耐药性NSCLC的潜在靶点。

[关键词] 非小细胞肺癌;miR-501;吉非替尼耐药;BLID

[中图分类号] R734.2          [文献标识码] A          [文章编号] 1673-7210（2020）04（c）-0018-06

The malignant phenotype of gefitini-resistant non-small cell lung cancer mediated by miR-501 targeted BLID

GE Ling1   CHEN Hejian2   XU Hangdi3

1.Department of Pharmacy， Zhuji Hospital Affiliated to Wenzhou Medical University， Zhejiang Province， Zhuji   311800， China; 2.Department of Respiratory Medicine， Zhuji Hospital Affiliated to Wenzhou Medical University， Zhejiang Province， Zhuji   311800， China; 3.Medical College of Zhejiang University， Zhejiang Province， Hangzhou   310058， China

[Abstract] Objective To explore the role of miR-501 in non-small cell lung cancer （NSCLC） with gefitinib resistance and its underlying mechanism. Methods The expression of miR-501 in NSCLC with gefitinib resistance serum and PC9/GR were evaluated by quantitative real-time polymerase chain reaction （qRT-PCR）. The effect of miR-501 on the malignant phenotype of PC9/GR was detected by CCK-8， scratch test and Transwell test. The online database was used to predict the potential target of miR-501 and to verify its specific role in PC9/GR. Results Compared with the healthy control people and the normal lung epithelial cell lines， the expression level of miR-501 in gefitini-resistant NSCLC  patients serum and PC9/GR were increased， and the differences were highly statistically significant （P < 0.01）. Compared with the mimics NC， the proliferation， migration and invasion capacity of PC9/GR in the miR-501 mimics were increased， and the differences were highly statistically significant （P < 0.01）. The luciferase reporter assay confirmed that BLID was a direct target for miR-501. Compared with the miR-501 mimics+pcDNA3.1， the proliferation， migration and invasion of PC9/GR in the miR-501 mimics+ pcdna3.1-blid were decreased， and the differences were highly statistically significant （P < 0.01）. Conclusion The upregulation of miR-501 promoted the proliferation， migration， and invasion of geffitini-resistant NSCLC by inhibiting BLID. Therefore， miR-501 is a potential target for gefitinib-resistant NSCLC.

[Key words] Non-small cell lung cancer; miR-501; Gefitinib resistance; BLID

肺癌是呼吸系统最常见的恶性肿瘤，其发病率和死亡率在全球范围内位居第一[1]。在病理分类中，肺癌的主要亚型是非小细胞肺癌（NSCLC）。目前，多种治疗方式均可用于临床治疗NSCLC。分子靶向药吉非替尼的出现为一部分NSCLC患者带来更好的临床收益[2-3]。有研究显示[4]，大多数接受吉非替尼治疗的NSCLC患者会出现耐药性。微小RNA（miRNAs）是一类存在于生物体的非编码RNA分子，其长度为21～25个核苷酸，通过结合mRNAs的3′端非翻译区，调节蛋白表达，进而在多种生理和病理过程中发挥作用[5-6]。miR-501是定位于X染色体的miRNA分子，介导胃癌对化疗药物阿霉素的耐药性产生，并且与BLID的抑制表达相关[7]。在结直肠癌中，miR-501介导五氟尿嘧啶耐药性肿瘤细胞的增殖[8]。这些研究均提示，miR-501在肿瘤耐药性中扮演重要角色。近期的一项研究显示[9]，miR-501在肺腺癌中显著高表达。Wang等[10]发现，BLID在NSCLC中顯著低表达。基于以上发现，本研究推测miR-501可能在吉非替尼耐药性NSCLC中发挥关键作用。

1 资料与方法

1.1 一般资料

选取2018年1～10月就诊于温州医科大学附属诸暨医院（以下简称“我院”）初诊NSCLC患者6例为初诊NSCLC组和吉非替尼耐药性NSCLC患者6例为吉非替尼耐药性NSCLC组，同期健康体检者6名为健康对照组。三组性别、年龄、体重比较，差异无统计学意义（P > 0.05），具有可比性，见表1。受试对象均被告知本试验的研究目的，并签署知情同意书。涉及的操作经我院医学伦理委员会批准。

表1   三组一般资料比较

1.2 细胞系

正常人肺上皮细胞系BEAS-2B、人NSCLC细胞系PC9和人胚胎肾细胞系HEK-293T均购于美国ATCC公司;吉非替尼耐药性PC9细胞系PC9/GR由PC9细胞系构建，保存于温州医科大学科研实验中心。

1.3 试剂与仪器

胎牛血清FBS（货号：10099）、RPMI-1640培养基（货号：12633012）和DMEM培养基（货号：12491015）购于美国Gibco;miRNeasy Serum/Plasma试剂盒（货号：217184）和miRNeasy Mini试剂盒（货号：217004）购于德国Qiagen;SYBR Premix Ex Taq Ⅱ试剂盒（货号：DRR081A）购于日本Takara;引物、miR-501 mimics、BLID过表达质粒、载有野生型BLID和突变型BLID的载体pGL3购于中国生工;Lipofectamine 3000（货号：L3000015）购于美国Invitrogen;吉非替尼（货号：SML1 657）购于美国Sigma-Aldrich;CCK-8试剂盒（货号：C0038）、RIPA裂解液（货号：P0013B）、BCA蛋白浓度测定试剂盒（货号：P0012）、SDS-PAGE凝胶配制试剂盒（货号：P0012A）、小鼠抗GAPDH单克隆抗体（货号：AF0006）和辣根过氧化物酶耦合二抗（货号：A0208、A0216）购于中国碧云天;Transwell小室（货号：354480）购于美国CORNING;PVDF膜（货号：IPVH00010）购于美国Millipore;兔抗BLID多克隆抗体（货号：ab230129）购于美国Abcam;荧光素酶报告基因检测试剂盒（货号：G7940）购于美国Promega;倒置显微镜（IXplore Standard）购于日本奥林巴斯;实时定量PCR仪（CFX384 TouchTM）、电泳转膜仪（Mini-PROTEAN？誖 Tetra Cell）、化学发光仪（ChemiDoc XRS+）和酶标仪（iMark）购于美国Bio-Rad。

1.4 方法

1.4.1 细胞培养  PC9、PC9/GR和HEK-293T培养于含10%胎牛血清的DMEM培养基，BEAS-2B培养于含10%胎牛血清的RPMI-1640培养基，隔天换液，在5% CO2、37℃条件下进行培养，当细胞密度达到80%时进行传代。

1.4.2 PC9/GR构建和分组  处于对数生长期的PC9加入含有吉非替尼的培养基，浓度从100 nmol/L开始，培养24 h后，弃培养基和漂浮细胞，加入新鲜培养基。当耐药细胞在不含吉非替尼的培养基生长至对数期，提高吉非替尼浓度，反复诱导，直至细胞在1 μmol/L吉非替尼下稳定生长，即得到实验所用PC9/GR。实验分组：①miR-501 mimics+gefitinib组和mimics NC+gefitinib组;②共转染野生型BLID和mimics NC组和共转染野生型BLID和miR-501 mimics组;③pcDNA3.1-BLID组和pcDNA3.1组;④miR-501 mimics+pcDNA3.1-BLID+gefitinib组和miR-501 mimics+pcDNA3.1+gefitinib组。

1.4.3 实时荧光定量PCR  血清miRNA的提取用miRNeasy Serum/Plasma试剂盒，细胞miRNA用miR-Neasy Mini试剂盒提取，经反转录后获得cDNA后，用SYBR Premix Ex Taq Ⅱ试剂盒进行实时荧光定量，程序设定为95℃、10 min，然后40个循环为95℃、30 s，55℃、30 s，72℃、30 s。U6作为微小RNA内参，采用2-ΔΔCt方法计算相对表达。hsa-miR-501：正义链5′-CTGCTCTGCTCGTCCTCTCT-3′，反义链5′-CTCCTGTCCTCACATGAAGA-3′。U6：正义链5′-AGGGG-CCATCCACAGTCTTC-3′，反义链5′-AACGCTTCACGAATTTGCGT-3′。

1.4.4 细胞活力测定  PC9和PC9/GR接种于96孔板，每孔细胞数约8000个，用含有1 μmol/L吉非替尼的培养基培养，在4、24、48 h和72 h测定OD值。将PC9/GR接种于96孔板，每孔细胞数约为6000个，将miR-501 mimics（1.5 μL）、BLID过表达质粒（1.5 μL），利用Lipofectamine 3000转染至PC9/GR培养48 h，然后更换培养基，在4、24、48 h和72 h测定OD值。本研究中，每孔100 μL培养基加入10 μL的CCK-8反应液，培养2 h后于酶标仪测定，波长设定450 nm。miR-501 mimics序列：5′-AGAAUCCUUGCCCGGGUGCAUU-3′。阴性对照mimics NC序列：5′-GUCGGUUCGCAUACUCACUGGA-3′。

1.4.5 细胞划痕实验  将转染了miR-501 mimics、pcDNA3.1-BLID的PC9/GR接种于6孔板，每孔细胞数密度约为2.5×105个，过夜培养后，用移液管尖端进行划痕，用无菌PBS轻轻洗去划下的细胞，加入无血清培养基常规培养，24 h后进行拍照。

1.4.6 Transwell實验  将转染了miR-501 mimics、pcDNA3.1-BLID的PC9/GR在无血清的培养基重悬，Transwell小室的上室接种约2×105个细胞，Transwell小室的下室倒入含血清的培养基。在细胞孵箱培养24 h后，用甲醇固定下室细胞，并用0.5%结晶紫染色20 min，然后在倒置显微镜下观察、拍照并计数。

1.4.7 荧光素酶报告基因实验  荧光素酶报告基因实验在HEK-293T中进行。HEK-293T接种于96孔板，约8000个/孔，将载有野生型BLID的pGL3（1.5 μL）与miR-501 mimics（1.5 μL）、载有突变型BLID的pGL3（1.5 μL）与miR-501 mimics（1.5 μL）、载有野生型BLID的pGL3（1.5 μL）与mimics NC（1.5 μL）、载有突变型BLID的pGL3（1.5 μL）与mimics NC（1.5 μL）分别利用Lipofectamine 3000共转染至HEK-293T内，48 h后用Bio-GloTM Luciferase Assay System检测，分析数值。

1.4.8 蛋白免疫印迹实验  收集PC9/GR，用RIPA裂解，BCA法蛋白浓度定量;蛋白样品用SDS-PAGE凝胶分离，然后转至PVDF膜;PVDF膜用5%脱脂奶粉封闭2 h;抗BLID和GAPDH一抗在-4℃过夜孵育;TBST洗膜后，用辣根过氧化物酶耦合的二抗在室温孵育PVDF膜2 h;ChemDocTM XRS+ System仪器检测目的条带，并用Image Lab软件进行灰度分析。

1.5 统计学方法

采用GraphPad Prism 5软件进行数据分析，计量资料用均数±标准差（x±s）表示，组间比较用非参数t检验，多组数据分析使用单因素方差分析，两两比较采用LSD检验;计数资料以构成比表示，采用χ2检验。以P < 0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 miR-501的表达水平

与健康对照组比较，初诊NSCLC组、吉非替尼耐药性NSCLC组血清miR-501表达水平升高（P < 0.01），且吉非替尼耐药性NSCLC组血清miR-501表达水平高于初诊NSCLC组（P < 0.05）（图1A）。此外，qRT-PCR检测细胞系显示，PC9和PC9/GR的miR-501表达水平高于BEAS-2B（P < 0.01），且PC9/GR的miR-501表达水平高于PC9（P < 0.01）（图1B）。

A：miR-501在NSCLC患者和健康对照血清中的表达;B：miR-501在NSCLC细胞系PC9和人正常肺上皮细胞系BEAS-2B的表达。*P < 0.05，**P < 0.01，***P < 0.001。NSCLC：非小细肺癌

图1   miR-501在吉非替尼耐药性NSCLC的表达

2.2 miR-501在PC9/GR中的作用

与4 h比较，PC9/GR正常生长，而PC9的增殖能力明显降低（P < 0.01）（图2A）。miR-501 mimics+gefitinib组PC9/GR增殖能力高于mimics NC+gefitinib组（P < 0.01）（图2B）。miR-501 mimics+gefitinib组细胞迁移能力高于mimics NC+gefitinib组（P < 0.01）（图2C）。Transwell实验结果显示，miR-501 mimics+gefitinib组细胞侵袭能力高于mimics NC+gefitinib组（P < 0.01）（图2D）。

2.3 miR-501的靶点鉴定

与mimics NC组比较，共转染野生型BLID和miR-501 mimics组的荧光素酶活性显著减低（P < 0.01）（图3A）。miR-501 mimics组PC9/GR的BLID蛋白表达水平低于mimics NC组（P < 0.01）（图3B）。

2.4 miR-501/BLID轴在PC9/GR中的作用

将BLID过表达质粒转染至PC9/GR，pcDNA3.1-BLID组BLID的蛋白表达水平显著高于pcDNA3.1组（P < 0.01）（图4A）。miR-501 mimics+pcDNA3.1-BLID+gefitinib组的细胞活力低于miR-501 mimics+pcDNA3.1+gefitinib组（P < 0.01）（图3B）。miR-501 mimics+pcDNA3.1-BLID+gefitinib组PC9/GR的迁移能力和侵袭能力均低于miR-501 mimics+pcDNA3.1+gefitinib组（P < 0.05或P < 0.01）（图4C～D）。

3 討论

肺癌是肿瘤相关性致死的主要恶性疾病，80%～85%的肺癌属于NSCLC[11]。研究发现20%～40%NSCLC患者存在表皮生长因子受体（EGFR）突变[12]。分子靶向药物吉非替尼是一种酪氨酸激酶抑制剂，与EGFR的ATP结合位点竞争性结合，用于携有EGFR突变的NSCLC患者[13]。然而，临床使用发现，接受吉非替尼治疗的NSCLC患者在中位治疗期约10个月后会产生对吉非替尼的耐药性，导致治疗失败[4]。因此，寻找NSCLC吉非替尼耐药靶点有助于为临床治疗NSCLC提供更好的策略。

大量研究证实，miRNAs在NSCLC的耐药性产生中发挥重要作用。Zhang等[14]发现，miR-135a诱导促细胞增殖相关蛋白RAC1上调介导NSCLC细胞的吉非替尼耐药性。临床样本结果提示，携有EGFR突变的NSCLC血清出现miR-214表达显著增高;进一步的细胞学实验结果显示，下调miR-214可抑制厄洛替尼耐药性NSCLC细胞的迁移和侵袭能力，增加其对厄洛替尼的敏感性[15]。这些研究提示，miRNAs具有促进NSCLC耐药性产生的作用。此外，抑制miR-873可促进NSCLC细胞的吉非替尼耐药性[16]。与之类似的是，沉默miR-483-3p的表达诱导EGFR突变型NSCLC细胞出现上皮-间质转化，并降低肿瘤细胞对吉非替尼的敏感性[17]，提示不同miRNAs分子在NSCLC的耐药性产生中扮演相反的角色。本研究结果提示，miR-501在吉非替尼耐药性NSCLC患者和细胞系中均出现上调表达。离体实验明确miR-501抑制BLID的表达，进而促进PC9/GR细胞增殖、迁移和侵袭能力。

BLID是凋亡相关蛋白Bcl-2家族分子，在多种肿瘤组织中显著低表达，并参与肿瘤耐药性。在乳腺癌和卵巢癌中，BLID的缺失表达介导肿瘤细胞对PARP抑制剂的耐药性[18]。Goldsmith等[19]研究证实，下调表达的BLID与神经母细胞瘤的治疗反应和耐药性相关。另有研究显示[20]，miR-501在阿霉素耐药的胃癌组织和细胞中高表达，通过抑制BLID的表达介导阿霉素的耐药性。该课题组进一步实验明确，miR-501主要来源于阿霉素耐药性胃癌细胞的外泌体[7]。本研究结果与其类似，并发现在PC9/GR细胞中转染BLID过表达质粒可逆转肿瘤细胞的恶性生物学行为。

综上，miR-501具有促进吉非替尼耐药性NSCLC细胞增殖、迁移和侵袭的作用，而且其作用与抑制BLID表达有关。因此，这些结果初步提示miR-501/BLID轴促进吉非替尼耐药性NSCLC细胞增殖、迁移和侵袭能力，而抑制miR-501可能有助于阻断吉非替尼耐药性NSCLC的进展。

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（收稿日期：2019-12-13  本文編辑：刘永巧）