抗病毒感冒颗粒质量标准研究

徐媛 张婷婷 张瑞涛 吴丹 党学良 刘梅 张琰

[摘要] 目的 建立抗病毒感冒颗粒的质量标准，更好地控制产品质量，为临床安全应用提供保障。 方法 采用薄层色谱法（TLC）对抗病毒感冒颗粒中的柴胡、忍冬藤、板蓝根进行定性鉴别。采用高效液相色谱法对忍冬藤主要有效成分马钱苷进行含量测定，以ODS-3为色谱柱，乙腈-水（12∶88）为流动相，检测波长236 nm。 结果 TLC斑点清晰、分离度好、专属性强、阴性对照无干扰;马钱苷在4.72～236.00 μg/mL浓度范围内与峰面积呈良好的线性关系（r = 0.9999），平均回收率为100.57%，RSD值为1.19%（n = 6），3批抗病毒感冒颗粒含量测定结果分别为0.4335、0.3741、0.3142 mg/g。 结论 所建立的定性、定量方法准确、可靠、重复性好，可作为抗病毒感冒颗粒的质量控制方法。

[关键词] 抗病毒感冒颗粒;质量标准;薄层色谱法;高效液相色谱法

[中图分类号] R282          [文献标识码] A          [文章编号] 1673-7210（2020）04（c）-0014-04

Quality standard for Kangbingduganmao Granules

XU Yuan   ZHANG Tingting   ZHANG Ruitao   WU Dan   DANG Xueliang   LIU Mei   ZHANG Yan

Department of Pharmacy， the Second Affiliated Hospital of Air Force Medical University， Shaanxi Province， Xi′an   710038， China

[Abstract] Objective To establish the quality standard of Kangbingduganmao Granules， to better control the product quality and to provide guarantee for clinical safety application. Methods Bupleuri Radix， Lonicerae Japonicae Caulis and Isatidis Radix in Kangweiganmao Granules were identified qualitatively by thin layer chromatography （TLC）. The content of loganin， the main effective component of Lonicerae Japonicae Caulis was determined by high performance liquid chromatography. The ODS-3 was used as the column and acetonitrile-water （12∶88） was used as the mobile phase， the detection wavelength was 236 nm. Results TLC spots were clear， the resolution was good， specificity was strong， and negative control had no interference. The loganin in the range of 4.72-236.00 μg/mL showed good linear relationship with the peak area （r = 0.9999）. The average recovery rate was 100.57% and RSD was 1.19% （n = 6）. The determination results of three batches of samples were 0.4335， 0.3741 and 0.3142 mg/g respectively. Conclusion The established qualitative and quantitative methods are accurate， reliable and reproducible， and can be used as quality control methods for antiviral cold granules.

[Key words] Kangbingduganmao Granules; Quality standard; Thin layer chromatography; High performance liquid chromatography

抗病毒感冒顆粒为柴胡、忍冬藤、板蓝根、石膏、大青叶等中药经提取制得的颗粒剂，具有清热解毒、清肺止咳的功效，用于病毒性感冒。抗病毒感冒颗粒是空军军医大学第二附属医院院内制剂，已应用于临床多年，疗效显著。原质量标准仅对处方中黄芩进行薄层色谱鉴别，且鉴别方法重复性差。为控制制剂质量，保证用药安全，对制剂质量标准进行研究。本研究对君药忍冬藤中主要功效成分马钱苷进行高效液相色谱法含量测定，对君药忍冬藤、臣药柴胡、板蓝根进行薄层鉴别，并参照“药品质量标准分析方法验证指导原则”[1]。对薄层鉴别及含量测定方法进行方法学验证。

1 仪器与试药

高效液相色谱仪（Agilent 1260型）;电子天平（Sartorius，CP225D，精密度十万分之一）;超声波清洗器（昆山禾创超声仪器有限公司，KH5200DB）。

马钱苷、柴胡皂苷a、R，S-告依春、板蓝根对照药材（中国食品药品检定研究院，批号：111640-201005、110777-201711、111753-201706、121177-201608）;抗病毒感冒颗粒（空军军医大学第二附属医院药剂科制备，规格：10 g/袋，批号：20171015、20171016、20171017）。硅胶G薄层板（浙江省台州市路桥四甲生化塑料厂，绦纶片基，规格10 cm×10 cm;青岛海浪硅胶干燥剂有限公司，玻璃片基，规格：100 mm×100 mm;厚度：0.20～0.25 mm;青岛海洋化工厂分厂，玻璃片基，规格：100 mm×100 mm;厚度：0.20～0.25 mm）;甲醇（Honeywell，色谱纯）;水为纯净水，其余试剂均为分析纯。

2 方法与结果

2.1 薄层色谱鉴别

2.1.1 忍冬藤、柴胡  取本品20 g，加水饱和正丁醇100 mL，超声30 min，滤过，滤液加氨试液洗涤两次，每次50 mL，正丁醇液蒸干，残渣加1 mL甲醇溶解。另取马钱苷及柴胡皂苷a对照品适量，加甲醇溶解，制成每毫升分别含1、0.5 mg的对照溶液。用薄层色谱法鉴别，分别吸取上述两种溶液各20 μL，点于硅胶G薄层板上，展开剂为二氯甲烷-乙酸乙酯-甲醇-水（30∶40∶22∶10）放置后的下层溶液。取出，晾干，喷以10%硫酸乙醇溶液，在105℃加热至斑点清晰显色。供试品溶液在与对照品溶液相应的位置上显相同颜色的斑点，阴性对照无此斑点。见图1～2。

1：马钱苷;2～4：抗病毒感冒颗粒供试品;5：缺忍冬藤的阴性供试品

图1   忍冬藤薄层色谱图

2.1.2 板蓝根  取本品20 g，加水100 mL，超声30 min，摇匀，3000 r/min离心3 min，取上清液，加乙酸乙酯振摇提取两次，每次20 mL，乙酸乙酯液合并，旋蒸至干，残渣用甲醇1 mL溶解，作为供试品溶液。另取板蓝根对照药材1 g，按供试品溶液制备法操作，作为对照药材溶液。再取R，S-告依春对照品，加甲醇制成1 mg/mL的溶液作为对照品溶液。采用薄层色谱法，吸取上述3种溶液各20 μL，分别点于硅胶GF254薄层板上，展开剂为石油醚（60～90℃）-乙酸乙酯（1∶1）。取出，晾干，置紫外灯（254 nm）下進行检视。供试品溶液在与对照药材及对照品溶液相应的位置上显相同的荧光斑点，阴性对照无此斑点。见图3。

1：R，S-告依春;2：板蓝根对照药材;3～5：抗病毒感冒颗粒供试品;6：缺板蓝根的阴性供试品

图3   板蓝根薄层色谱图

2.2 马钱苷的含量测定

2.2.1 色谱条件  色谱柱：Inertsil ODS-3（5 μm，250 mm×4.6 mm）;流动相：乙腈-水（12∶88）等度洗脱;检测波长：236 nm;流速：1.0 mL/min。

2.2.2 溶液配置  对照品溶液：取马钱苷对照品适量，加甲醇制成20 μg/mL的溶液，即得。

供试品溶液：取本品3 g，精密称定，置50 mL量瓶中，加水40 mL，超声30 min，放冷，加水至刻度，摇匀，3000 r/min离心3 min，取上清液10 mL，加入大孔吸附树脂柱（内径为1.2 cm，柱高为10 cm），以100 mL水洗脱，弃去水液，继用70%乙醇100 mL洗脱，收集洗脱液，蒸干，残渣加甲醇溶解并定容至10 mL，摇匀，即得。

阴性对照溶液：取不含马钱药材的阴性对照颗粒3 g，按供试品溶液制备方法操作，即得。

2.2.3 专属性实验  按照“2.2.1”项下色谱条件，取“2.2.2”项下3种溶液分别进样10 μL测定，得到色谱图。见图4。图中马钱苷与其他成分分离度良好（分离度>1.5），保留时间约为17 min，且阴性对照溶液在相同保留时间处未见明显干扰色谱峰。

①：对照品溶液;②：供试品溶液;③：阴性对照溶液

图4   马钱苷HPLC谱图

2.2.4 标准曲线的制备  取马钱苷对照品11.8 mg，置50 mL量瓶中，加甲醇溶解并定容，摇匀，配制浓度为236.00 μg/mL的马钱苷对照品储备液。吸取上述对照品储备液适量，加甲醇稀释至浓度分别为4.72、9.44、23.60、47.20、118.00 μg/mL的系列对照品溶液。精密吸取各浓度的对照品溶液各10 μL，分别进样测定。以峰面积（A）对浓度（C）做线性回归，得到标准曲线方程：A =21.7652 C+36.8343（r = 0.9999）。提示马钱苷在4.72～236.00 μg/mL范围内线性关系良好。

2.2.5 精密度实验  按“2.2.2”项下方法制备对照品溶液及供试品溶液，重复进样6次，记录峰面积，计算供试品中马钱苷的含量，计算精密度。结果显示，马钱苷含量测定的精密度RSD分别为0.28%、0.78%，该仪器精密度良好。

2.2.6 中间精密度实验  取同一批次（批号：20151016）抗病毒感冒颗粒，由不同分析人员于不同日期分别按“2.2.2”项下方法制备对照品溶液及供试品溶液，进样测定并计算马钱苷含量，测定6次，计算得平均含量为0.4335 mg/g，测定结果RSD为0.97%，中间精密度良好。

2.2.7 回收率实验  取马钱苷对照品，加甲醇制成浓度为660.80 μg/mL的对照品溶液。取同一批次（批号：20151016）抗病毒感冒颗粒（其中马钱苷含量为0.4335 mg/g）9份，每份1.5 g，精密称定。分别精密加入浓度为660.80 μg/mL的对照品溶液0.5、1.0、1.5 mL各3份，按“2.2.2”项下供试品溶液制备方法制成加样回收供试品溶液，测定马钱苷含量，计算得平均回收率为100.57%，RSD为1.19%。见表1。

表1   加样回收率实验结果

2.2.8 稳定性实验  按“2.2.2”项下方法制备对照品溶液及供试品溶液，分别于0、2、4、8、12、24 h进样，测定峰面积。计算得RSD分别为1.96%、1.12%。對照品溶液及供试品溶液在配置后24 h内较稳定。

2.2.9 样品含量测定  取3批抗病毒感冒颗粒，测定并计算马钱苷的含量。见表2。

表2   3批抗病毒感冒颗粒测定

2.2.10 含量限度的制订  《中华人民共和国药典》[2]一部规定忍冬藤中马钱苷含量不得低于0.10%，制剂中忍冬藤经提取后入药。按“如所测成分的原料在制备工艺中经溶剂提取，该成分转移率一般应不低于30%”的标准，计算得制剂中马钱苷含量应不得低于0.6 mg/袋。故制订本品含量限度为：本品每袋含忍冬藤以马钱苷（C17H26O10）计，不得少于0.6 mg。计算方法如下：0.1%×2000 g×30%/1000 袋=0.6 mg/袋。

3 讨论

3.1 柴胡、忍冬藤薄层鉴别

君药忍冬藤功效清热解毒，疏风通络，具有抗病毒作用[3];臣药柴胡功效疏肝解郁退热，具有解热抗炎作用[4]。忍冬藤、柴胡主要功效成分均为皂苷类，《中华人民共和国药典》[2]中分别对忍冬藤中马钱苷及柴胡中柴胡皂苷a、柴胡皂苷d进行鉴别。参考药典及文献[2，6-9]，对供试品分别采用50%甲醇超声、甲醇超声提取，并进行5%浓氨甲醇除杂、正丁醇萃取、氧化铝柱富集、大孔树脂柱富集，均无法得到清晰斑点[5]。以正丁醇超声提取，氨试液洗涤净化，可同时得到柴胡皂苷a及马钱苷斑点。可能因柴胡皂苷d经长时间受热水解开环生成柴胡皂苷b1、b2无法检测到[10-11]，故仅对柴胡皂苷a及马钱苷进行鉴别，方法操作简单，斑点清晰。经对多种展开剂进行比较，最终确定以二氯甲烷-乙酸乙酯-甲醇-水（30∶40∶22∶10）放置后的下层溶液为展开剂，可将多种皂苷成分清晰分离。

3.2 板蓝根薄层鉴别

板蓝根、大青叶功能清热解毒，具有抗病原微生物作用[12-14]。此二药化学成分类似，主要含靛玉红、靛蓝及氨基酸类成分[15-17]。经多种试验方法研究[17]，二者相互干扰，无法对这些成分进行鉴别。后对板蓝根中具有抗流感病毒作用的特征性成分（R，S）-告依春进行鉴别研究[18-20]，分别对乙酸乙酯、甲醇、80%甲醇、水提取，经大孔树脂、中性氧化铝富集，以不同浓度乙醇洗脱进行比较优选[21]，最终以水提取，乙酸乙酯萃取，得到满意效果。

3.3 薄层鉴别方法学验证

实验中对不同供试品前处理方法、提取时间、提取次数、萃取次数、展开剂条件进行了比较研究，对溶液稳定性（24 h）进行了考察，对不同品牌薄层板（台州、海洋、海浪）、不同展开温度（4℃、25℃、45℃）、不同展开湿度（32%、45%、88%）进行比较研究，最终确定薄层鉴别方法。

3.4 马钱苷含量测定

《中华人民共和国药典》[2]中忍冬藤含量测定指标为马钱苷，本研究参考药典对马钱苷进行含量测定。分别采用比较试验，对供试品提取溶剂（甲醇、80%甲醇、30%甲醇、70%乙醇、30%乙醇）、提取方法（超声、回流、浸泡）、溶剂用量、提取时间进行优选，对提取液净化方法，大孔树脂吸附水、70%乙醇洗脱量进行比较，最终确定供试品制备方法。药典中采用乙腈-0.4%磷酸溶液（10∶90）为流动相，实验中与乙腈-水（12∶88）进行比较，发现两种流动相无显著差别，故确定选用后者。

采用耐用性实验，对流动相比例（12∶88、10∶90、15∶85）、柱温（2±5）℃、流速（1.0±0.1）mL/min、检测波长（227±1）nm、色谱柱（Inertsil ODS-3、Agilent SB C18）进行比较，结果所得色谱峰分离度均良好，含量RSD分别为0.60%、1.72%、1.11%、0.46%、0.67%。提示该方法在测定条件有小的变动时，测定结果无显著差异，系统适应性良好。

[参考文献]

[1]  中华人民共和国药典[S].2015年版.四部.北京：中国医药科技出版社：57-59，59-61，371-373.

[2]  中华人民共和国药典[S].2015年版.一部.北京：中国医药科技出版社：21，94-95，193，205，224，280.

[3]  鲁思爱.忍冬藤的化学成分及其药理应用研究进展[J].临沂大学学报，2012，34（3）：132-134.

[4]  颜美玲，杨柳，侯阿娇，等.柴胡化学成分及药理作用研究进展[J].中医药信息，2018，35（5）：103-109.

[5]  马云，王尧尧，张玉，等.金银花、忍冬藤药材质量标准研究进展[J].辽宁中医药大学学报，2018，20（8）：70-77.

[6]  马杰，孙焱，丁野，等.复方石淋通胶囊质量标准的修订研究[J].中国药师，2015，18（8）：1284-1286.

[7]  郭静，周春玲.口腔炎喷雾剂的质量标准研究[J].中国药师，2013，16（3）：376-378.

[8]  徐英辉，申茹，郭玉岩.忍冬藤胶囊的制备及其质量标准[J].中成药，2019，41（8）：1790-1794.

[9]  高辉，于英俊，沈涛，等.忍冬藤饮片质量标准研究[J].药学研究，2018，37（6）：332-334，364.

[10]  赖克道，刘元，文志云，等.薄层色谱法定性鉴别小柴胡颗粒中的柴胡、甘草[J].广西医学，2009，31（6）：886-887.

[11]  郭智，彭冰，李宗阳，等.UPLC-QTof -MS测定不同提取条件下柴胡皂苷a和柴胡皂苷d的转化规律[J].天然产物研究与开发.2014，26：716-720.

[12]  王建敏，李伟.板蓝根颗粒中有效成分的测定及药理作用研究进展[J].中国医药导报，2019，16（18）：49-52.

[13]  杨春风，孔庆耀，孙铭君.浅谈大青叶的研究进展[J].山东畜牧兽医，2019，40（5）：78-80.

[14]  罗芬.大青叶水提物抗甲型流感病毒活性研究[J].新乡医学院学报，2017，34（10）：881-884.

[15]  黄远，李菁，徐科一，等.板蓝根抗流感病毒有效成分研究进展[J/OL].中国现代应用药学，2019，36（20）：2618-2623.

[16]  刘富康，方士元，曲映红.大青叶粗黄酮提取及其抑菌性研究[J].山东化工，2018，47（21）：34-35，38.

[17]  闫峻，顾娟，冯硕，等.大青叶化学成分及抗氧化活性研究[J].质谱学报，2019，40（4）：381-390.

[18]  彭婷婷，江勋，周峰.复方板蓝根颗粒及板蓝根的质量研究概况[J].中成药，2017，39（12）：2573-2575.

[19]  华之卉，刘栋，李明春.双波长HPLC法同时测定板柴口服液中（R，S）-告依春和绿原酸的含量[J].中国药房，2017，28（27）：3853-3855.

[20]  肖雪，马晋芳，罗国安.HPLC法测定板蓝根中抗病毒化学物质组的含量[J].江西中医药，2018，49（11）：67-69.

[21]  莫迎.不同的提取方法对板蓝根中（R，S）告依春的影响[J].中医药导报，2011，17（6）：89-91.

（收稿日期：2019-09-30  本文编辑：刘永巧）