山茶油中原花青素的提取工艺优化及含量测定

王宗成 路大中 王守敏 郑辉煌 杨丽华 罗小芳

(湖南科技学院化学与生物工程学院1，永州 425199) (湖南科技学院湖南省生物质资源综合开发利用工程技术研究中心2，永州 425199)

油茶为我国特有的木本油料树种，是世界四大木本油料植物之一[1]，同时也是我国四大木本油料植物之一[2]。山茶油为油茶果实中通过压榨或浸出得到，其含有油酸、亚油酸、生育酚等营养物质，具有预防心血管疾病和降低胆固醇的作用[3-5]。

原花青素是一类黄烷醇单体及其聚合体的多酚化合物，也称缩合单宁。原花青素具有护肝降脂、防治动脉粥样硬化、抗氧化等药理学活性[6-8]。同时原花青素具有抗紫外线作用，常用在防晒护肤品中，被西方称为“口服化妆品”和“皮肤维生素”[9,10]。

目前山茶油的研究主要集中在维生素E、角鲨烯和植物甾醇含量的测定等方面，对其原花青素含量极少报道[11,12]。原花青素能够清除自由基，明显增强油脂的抗氧化性，因此测定油脂中原花青素含量对油脂抗氧化性研究具有指导意义[13]。原花青素含量测定方法有高效液相色谱法[14]、香草醛-盐酸法和香草醛-硫酸法[15]等方法。高效液相色谱法具有测量精度高、稳定性高和重复性好，但原料原花青素采用纯甲醇提取，而原花青素更易溶于甲醇水溶液中[16]。香草醛-盐酸法和香草醛-硫酸法弄够用来测定原花青素，但香草醛在浓酸作用下也能与五环三萜类化合物作用形成络合物影响测定结果[17]。

本研究在高效液相色谱法基础上研究适合山茶油的原花青素提取及含量测定方法，以期为山茶油的进一步研究和开发利用提供参考。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

山茶油：冷榨冷提工艺，产地为湖南衡阳；原花青素标准品：UV≥95%；甲醇、磷酸：色谱纯；其他试剂均为分析纯，水为蒸馏水。

AUW120型电子天平;UV-1750型紫外分光光度计;HH-6型恒温水浴锅;Agilent 1260型高效液相色谱仪。

1.2 方法

1.2.1 山茶油中原花青素提取

称取15 g样品于烧瓶中(精确到0.000 1 g)，加入20 mL一定浓度甲醇溶液，在一定温度下搅拌，冷凝回流萃取一定时间，离心，收集上清液(一次提取)，用相同甲醇溶液定容到100 mL，待测。

1.2.2 标准曲线制作

将原花青素标准样品用50%甲醇溶液溶解，并制备60、80、100、120、140 μg/mL的标准梯度溶液，吸取1 mL各标准梯度溶液分别置于不同的磨口锥形瓶中，加热真空挥干，分别加入15 mL正丁醇与盐酸的混合液(正丁醇∶盐酸=95∶5)，再加入0.2 mL 2%硫酸铁铵溶液(用浓度2 mmol/L盐酸配成2%的溶液)，混匀，置沸水浴回流，加热40 min后，立即至冰水浴冷却2 min，取出后放置室温10 min，于波长545 nm处测定吸光度。以吸光度为纵坐标(A)，原花青素标准梯度浓度为横坐标(X)，绘制标准曲线。

1.2.3 方法学考察

1.2.3.1 精密度试验

取1 mL浓度为80 μg/mL的原花青素标准溶液，按照标准曲线相同条件下进行操作测定吸光度，平行6份，计算RSD值。

1.2.3.2 重复性试验

分别吸取3 mL样品待测液置于6个不同的磨口锥形瓶中，按照标准曲线相同条件下进行操作测定吸光度，计算RSD值。

1.2.3.3 稳定性试验

吸取3 mL样品待测液，按照标准曲线相同条件下进行操作，每10 min测定一次吸光度，考察1 h内吸光度的稳定性，计算RSD值。

1.2.3.4 加样回收率试验

取6份3 mL已知含量的样品提取液，加入一定量的标准溶液混匀，按照标准曲线相同条件下进行操作测定吸光度，计算加样回收率和RSD值。

1.2.4 几种测定方法比较

方法一：取3 mL样品待测液按照标准曲线相同条件下进行操作测定山茶油中原花青素含量。

方法二：取样品待测液参照文献方法[13]进行高效液相色谱法测定山茶油中原花青素含量。

方法三：称取0.5 g油脂(精确至0.000 1 g)，用纯甲醇定容至50 mL容量瓶中，移取2mL溶液参照文献方法[13]进行高效液相色谱法测定山茶油中原花青素含量。

方法四：称取0.5 g油脂(精确至0.000 1 g)，加入15 mL正丁醇与盐酸的混合液(正丁醇 ∶盐酸=95∶5)，再加入0.2 mL 2%硫酸铁铵溶液(用浓度2 mmol/L盐酸配成2%的溶液)，混匀，置沸水浴回流，加热40 min后，立即至冰水浴冷却2 min，取出后放置室温10 min，于波长545 nm处测定吸光度。

1.2.5 单因素试验

1.2.5.1 甲醇溶液浓度的选择

采用提取温度为70 ℃、提取时间为40 min、提取次数2次，分别考察甲醇体积分数为30%、40%、50%、60%、70%条件下对原花青素含量的影响。

1.2.5.2 水浴温度的选择

采用甲醇体积分数为50%、提取时间为40 min、提取次数2次，分别考察水浴温度60、70、80、90、100 ℃条件下条件下对原花青素含量的影响。

1.2.5.3 提取时间的选择

采用甲醇体积分数为50%、水浴温度为70 ℃、提取次数2次，分别考察提取时间20、30、40、50、60 min条件下对原花青素含量的影响。

1.2.5.4 提取次数的选择

采用甲醇体积分数为50%、水浴温度为70 ℃、提取时间为40 min，分别考察提取次数1、2、3、4、5 次条件下对原花青素含量的影响。

1.2.6 正交试验

根据单因素试验结果，进行L9(34)正交试验，确定出山茶油中原花青素提取的最佳工艺参数。

2 结果与分析

2.1 标准曲线制作

按照1.2.2方法可得，原花青素标准样品的回归方程为A=0.004 3x+0.004 5(R2=0.999 4)。其浓度在60～140 μg范围内线性良好。原花青素标准样品的标准曲线如图1所示。

图1 原花青素标准样品的标准曲线

2.2 方法学考察

2.2.1 精密度试验

精密度试验结果见表1。

表1 精密度试验结果

由表1可知，精密度试验RSD值为1.23%，表明仪器精密度良好。

2.2.2 重复性试验

重复性试验结果见表2。

表2 重复性试验结果

由表2可知，重复性试验RSD值为2.43%，表明重复性良好。

2.2.3 稳定性试验

稳定性试验结果见表3。

表3 稳定性试验结果

由表3可知，稳定性试验RSD值为1.25%，表明待测样品在1 h内稳定。

2.2.4 加样回收率试验

加样回收率试验结果见表4。

表4 加样回收率试验结果

由表4可知，加样回收率试验平均加样回收率为100.18%，RSD值为1.41%，加样回收率范围98.70%～102.15%，表明该方法具有良好的加样回收率。

2.3 几种测定方法比较

几种测定方法比较见表5。

表5 几种测定方法比较

由表5可知，方法四比色液浑浊，直接导致原花青素含量结果严重偏高；方法二和方法三原花青素含量结果对比表明原花青素更易溶于甲醇溶液，因此用甲醇溶液提取更为准确；方法一和方法二原花青素含量结果非常接近，说明两种方法都适用于山茶油中原花青素含量的测定，为操作快速、方便，选择方法一。由方法一、方法二、方法三的原花青素含量结果与方法四的原花青素含量结果比较可知，甲醇溶液从山茶油中提取原花青素后测得的结果更为准确，因此准确测定山茶油中原花青素含量采用甲醇溶液从山茶油中先提取原花青素再进行比色测定结果。

2.4 单因素试验

各因素对原花青素含量影响如图2所示。

图2 各因素对原花青素含量影响

2.4.1 甲醇浓度的选择

甲醇溶液提取原花青素遵循相似相溶原理，调节甲醇体积分数，让其极性接近原花青素，从而达到原花青素的最高溶解度。由图2可知，随着甲醇体积分数升高，原花青素含量逐渐增加，但甲醇体积分数到达60%以后，原花青素含量反而减少。因此甲醇体积分数为50%～60%时提取原花青素效果较好。

2.4.2 水浴温度的选择

水浴温度对原花青素提取过程表现为两个方面：一方面，传质效率随着温度升高而增加；另一方面，温度过高，溶解在提取溶液中的杂质增加，这些杂质使得提取混合液黏度增加，进而影响原花青素的提取效率。由图2可知，原花青素含量随温度不断升高先增加后降低，当水浴温度达到70～80 ℃时，原花青素含量达到最大。因此水浴温度为70～80 ℃时，原花青素提取效果较好。

2.4.3 提取时间的选择

提取时间对原花青素提取过程的影响主要表现在提取溶剂与油脂混合，油脂中的原花青素溶解到提取溶剂中，直到油脂中原花青素浓度与提取溶剂原花青素浓度一致时，传质达到动态平衡，而当提取时间不足时，则原花青素提取不彻底。由图2可知，原花青素含量随提取时间的延长先增大后趋于平衡，当提取时间为40 min时，原花青素含量达到最大，当提取时间超过40 min，原花青素含量不再增加。因此选用提取时间为40 min。

2.4.4 提取次数的选择

提取次数对原花青素提取过程的影响主要表现在不断降低油脂中原花青素含量，使原花青素几乎全部溶解到提取溶液中。由图2可知，原花青素含量随提取次数的增加先增大后趋于平衡，当提取次数为3次时，原花青素含量达到最大，当提取次数超过3次，原花青素含量不再增加。因此选用提取次数为3次。

2.5 正交试验

在单因素试验的基础上，对甲醇浓度、水浴温度、提取时间和提取次数进行4因素3水平正交试验。正交试验结果见表6。

表6 正交试验结果

由表6中极差分析可知，影响原花青素含量的影响因素主次顺序为：A(甲醇体积分数)>C(提取时间)>B(水浴温度)>D(提取次数)。山茶油中原花青素最佳提取工艺组合为A2B2C2D3，即甲醇体积分数50%、水浴温度80 ℃、提取时间40 min、提取次数4次。

对正交试验得到的山茶油中原花青素最佳提取条件进行验证试验，验证试验结果见表7。

表7 验证试验结果

由表7可知，在甲醇体积分数50%、水浴温度80 ℃、提取时间40 min和提取4 次的提取工艺条件下，测得山茶油中平均原花青素含量为265.90 mg/Kg(RSD值为1.11%，说明重复性好)。

3 结论

通过单因素试验和正交试验相结合的方法优化山茶油中原花青素的提取，影响原花青素含量的影响因素从大到小依次为：甲醇浓度、提取时间、提取温度、提取次数。

山茶油中原花青素最佳提取工艺为甲醇体积分数50%、水浴温度80 ℃、提取时间40 min、提取4 次；在此条件下所提取得到山茶油中平均原花青素含量为265.90 mg/kg。

山茶油中原花青素的提取优化工艺稳定可行，且原花青素含量测定方法可靠。