肿瘤微环境促进子宫内膜癌细胞分泌雌激素

车 祺， 刘素英， 董 曦

复旦大学附属中山医院生殖医学中心，上海 200032

子宫内膜癌是威胁女性健康的常见恶性肿瘤之一，发病率在发达国家占女性恶性肿瘤的第4位，在发展中国家占女性恶性肿瘤的第7位，且近年来呈持续上升趋势[1]。子宫内膜癌的高发病率及高死亡率严重危害妇女健康及生存质量，早期诊断及有效治疗至关重要[2]。

已有研究[3-4]证实，子宫内膜癌组织中雌激素的浓度高于正常组织，说明雌激素不仅能以传统的内分泌方式作用于靶器官，还可能以局部分泌的方式，促进肿瘤的发展。芳香化酶是雌激素合成的限速酶，但是其在子宫内膜癌中的具体作用机制至今仍不清楚[5]。本研究通过子宫内膜癌细胞与间质细胞的共培养模型，研究子宫内膜癌细胞中芳香化酶及间质细胞中雌激素的合成关系，并筛查相关细胞因子。

1 资料与方法

1.1 子宫内膜癌间质细胞的提取 子宫内膜癌组织标本来自复旦大学附属中山医院。无菌条件下获取子宫内膜癌组织，0.9%氯化钠液洗涤，除去血块及黏液后，剪成1 mm3左右小块。离心后，加入0.1%Ⅰ型胶原酶，37℃恒温孵箱内消化。分别用100目和400目不锈钢筛网过滤消化后的细胞悬液。

1.2 双重免疫荧光染色鉴定间质细胞 细胞经甲醛固定，血清封闭后，同时用小鼠抗人波形蛋白抗体和兔抗人角蛋白抗体4℃孵育过夜；次日磷酸盐溶液(PBS)冲洗，滴加入异硫氰酸荧光素(FITC)标记的羊抗兔 (绿色)荧光和罗丹明标记的羊抗小鼠(红色)荧光二抗，避光放置2 h；4′,6-二脒基-2-苯基吲哚(DAPI)染细胞核，抗荧光淬灭封片剂封片。荧光显微镜观察染色结果。

1.3 子宫内膜癌细胞系的选取和培养 选取雌激素受体(estrogen receptor, ER)阳性的子宫内膜癌细胞系RL95-2(ERα和ERβ均阳性)、HEC-1A(ERα和ERβ均阳性)和HEC-1B(ERβ阳性)，用含10%胎牛血清(FBS)的DMEM/F12培养液培养， 在37℃、5% CO2培养箱培养。当细胞增殖至80%时，用0.25%胰酶(含有0.02%EDTA)消化传代，每2～3 d换液或传代1次，观察细胞生长情况。

1.5 细胞培养模式及雌激素合成检测 24孔细胞培养板购自美国Corning公司。Tanswell小室滤膜孔径为0.4 μm，膜为聚碳酸酯膜，保证细胞之间不直接接触，而培养液和可溶性因子可自由通过。共培养组24孔板下室中以2.3×105/L的密度接种子宫内膜癌间质细胞；Transwell小室中以(1～1.5)×105/L的密度接种3种子宫内膜癌细胞株(RL95-2、HEC-1A和HEC-1B)。单独培养组只在Transwell小室中接种子宫内膜癌细胞株。2组均培养5 d后，留取一部分培养液用于后续芯片筛查细胞因子，余培养液用于检测雌激素的含量。用化学发光免疫(UniCel DxI 800全自动化学发光免疫分析仪)雌激素的含量；荧光定量real-time PCR法检测肿瘤细胞内芳香化酶mRNA的表达。

1.6 细胞因子芯片筛查 选取差异最明显的一组细胞，留取细胞培养液上清，进行子宫内膜癌局部雌激素合成相关调控细胞因子的芯片筛查。人细胞因子芯片(RayBioTM抗体芯片)购自上海BioTNT公司，含507个人源性细胞因子抗体。根据芯片说明书，通过激光荧光检测芯片信号，芯片亮度越强说明相应的细胞因子含量越高。

1.7 生长分化因子-15(GDF-15)刺激芳香化酶的表达 将RL95-2、HEC-1A和HEC-1B分别接种于24孔板，孵育24 h至密度70%～80%融合，PBS洗3遍，换无血清培养液孵育过夜，分别用5、10、20、50、100 ng/mL浓度的GDF-15刺激24 h，提取细胞mRNA，经real-time PCR检测芳香化酶表达情况。

2 结 果

2.1 子宫内膜癌间质细胞鉴定 双重免疫细胞荧光染色结果图1显示，间质细胞的特征性蛋白(波形蛋白)为阳性染色，上皮细胞的特征性蛋白(角蛋白)为阴性染色，证实成功提取和培养了子宫内膜癌间质细胞。

图1 双重免疫细胞荧光染色坚定子宫内膜癌间质细胞

2.2 雌激素合成和芳香化酶表达情况 结果(图2)表明：共培养组培养上清中雌激素的浓度及肿瘤细胞中芳香化酶mRNA的含量均高于单独培养组。

2.3 2组差异性表达细胞因子的筛选 HEC-1A细胞中芳香化酶的表达的在2组间差异性最大，因此将其用于细胞因子筛查，结果表明，与代谢相关的细胞因子中，2组GDF-15的表达差异性最大(P<0.01)，见图3。

图2 2种培养模式下上清液中雌激素和肿瘤细胞内芳香化酶mRNA的表达

图3 2种培养模式下GDF-15的表达

2.4 不同浓度GDF-15对内膜癌细胞株芳香化酶表达的调节 real-time PCR结果(图4)显示：5、10、20、50、100 ng/mL的GDF-15刺激3种子宫内膜癌细胞株后，以10 ng/mL的GDF-15刺激细胞株中芳香化酶表达的作用最明显(P<0.01)。

图4 不同浓度的GDF-15对3种子宫内膜癌细胞株中芳香化酶表达的影响

3 讨 论

长期过量的雌激素可诱发子宫内膜癌的发生[6]，而子宫内膜癌中雌激素浓度远高于健康妇女血液和子宫内膜[3]。由此推测，子宫内膜癌中原位雌激素合成在其发生发展中起重要作用。芳香化酶是雌激素合成的限速酶，在卵巢的颗粒细胞、脂肪细胞、胎盘合体滋养层细胞和脑细胞等多种雌激素合成部位表达[5]。已有研究[7-8]表明，子宫内膜癌中芳香化酶的异常表达与肿瘤预后密切相关；在口服孕激素无效的绝经前子宫内膜癌患者中，芳香化酶抑制剂的治疗效果较好。

本研究中，子宫内膜癌细胞与间质细胞共培养组培养液上清中的雌激素及肿瘤细胞中的芳香化酶mRNA含量均高于子宫内膜癌细胞单独培养组，证实了肿瘤微环境对雌激素原位合成的作用。进一步培养液上清进行细胞因子芯片筛查，显示共培养组GDF-15升高。

GDF-15是一种应激反应蛋白，1997年由Bootcov等[9]首次在激活的巨噬细胞中发现。其定位于19p12.1～13.1，含有2个外显子和1个内含子，主要参与组织修复和调节器官生长、分化等生物学进程。GDF-15可促进肿瘤的转移，但也可促进肿瘤细胞的凋亡，这2种相互矛盾的作用及具体机制尚未被完全阐明[10]。研究[11]显示，血浆GDF-15的浓度可以作为前列腺癌、胰腺癌和结肠癌等多种恶性肿瘤的生物学预测指标。而且，GDF-15可以通过调节肿瘤微环境(如巨噬细胞的功能)来促进早期肿瘤的发展[12]。本研究中，GDF-15可以促进3种子宫内膜癌细胞株中芳香化酶的表达。由此推测，在子宫内膜癌微环境中，肿瘤间质细胞通过分泌GDF-15，调控癌细胞中芳香化酶的合成，进而导致子宫内膜癌原位雌激素的增加。

在卵巢癌患者血清中，GDF-15表达水平升高，可与CA125一起作为卵巢癌的早期诊断指标[13-14]。李会平等[15]发现，GDF -15 在子宫内膜癌组织中表达较高，且与肌层浸润深度正相关。国外研究[16-17]也表明，子宫内膜癌患者血清GDF-15 水平与肿瘤的淋巴结转移和预后密切相关，且可以作为肿瘤进展的独立预测因子，因此可作为子宫内膜癌进展、复发和预后的有效预测指标。另外，GDF-15与肥胖及新陈代谢之间存在明显的相关性[18]。GDF-15可通过延迟胃排空、激活末梢区神经元及促进脂肪分解的作用方式预防及治疗肥胖[19]。本研究证实，GDF-15可促进子宫内膜癌中芳香化酶的表达，这可能是GDF-15促进子宫内膜癌发展的新机制。

肿瘤细胞通过产生多种生长因子和趋化因子，并以旁分泌的方式激活间质细胞而活化肿瘤基质，而间质细胞被肿瘤细胞诱导后，也产生多种细胞因子及酶，进一步促进肿瘤细胞的增殖和侵袭[20]。正常细胞与周围的组织微环境之间存在着动态平衡，进而使维持细胞的正常生长和凋亡。而肿瘤恶变则破坏了这一平衡[21]。本研究发现，子宫内膜癌中GDF-15可以促进局部雌激素合成，这一细胞因此可能成为子宫内膜癌发病机制研究和治疗的潜在靶点。