体外法研究添加不同比例葡萄籽对多浪羊瘤胃发酵及底物降解的影响

彭婉婉，许贵善,2*，马忠杰，张皙藤，鸟鹏颖

（1.塔里木大学动物科学学院，新疆阿拉尔 843300；2.新疆生产建设兵团塔里木畜牧科技重点实验室，新疆阿拉尔 843300）

新疆是少数民族群众聚居区，对牛、羊肉等畜产品需求极大，但新疆尤其是南疆草地沙漠化严重，饲草资源短缺，饲料资源的开发和高效利用极其重要。新疆得天独厚的种植条件使其成为世界上三大适宜葡萄栽培的黄金区域之一。葡萄酿酒加工过程中产生大量的葡萄渣，主要成分是葡萄皮和葡萄籽，约占鲜果重量的20%[1]。

前人研究表明，葡萄渣用于养殖可以提高肉羊的生产性能、屠宰性能和部分养分的可消化性[2-3]。葡萄渣作为饲料或添加剂极具利用价值，但其中所含的单宁对反刍动物日粮蛋白质的消化吸收和代谢具有抑制作用，是限制葡萄渣添加量的主要因素[4]。饲喂过量的葡萄渣会使动物采食量下降，增加饲养成本，降低饲料养分的利用效率[5]。另外，葡萄渣中皮和籽的比例使其中的营养物质含量波动较大，研究结果不尽相同。葡萄籽营养物质含量稳定，但单宁含量较高，研究葡萄籽在肉羊饲料中的适宜添加量可为开发利用葡萄籽资源，提高蛋白质利用效率提供基础数据。

前人研究主要集中于葡萄渣，对葡萄籽添加比例的研究较少。本研究使用体外法探索葡萄籽在多浪羊全价日粮中的适宜添加量，以期为开展饲养试验提供基础数据，为葡萄籽及葡萄渣等副产物在肉羊生产中的应用提供一定理论依据。

1 材料与方法

1.1 瘤胃液供体动物 瘤胃液供体动物为16 只健康、体况良好、体重（33.0±3.2）kg 的多浪羊公羊（装有永久性瘤胃瘘管，外径9.8 cm，内径3.9 cm）。

1.2 试验饲粮与饲养管理 参照 NRC[6]（2007）配制体重为 30 kg、日增重为 150 g/d 绵羊营养需要量的全混颗粒饲料，由阿克苏某饲料公司代为生产。每天09:00和21:00 各饲喂1 次，自由饮水，单栏饲养，饲喂15 d后于晨饲前采集瘤胃液。

1.3 试验设计 试验设计了8 种饲料样品，将育肥羊全价配合饲料粉碎过筛，葡萄籽来自新疆伊犁某葡萄酒厂，自然干燥后葡萄籽含水分9.93%，干物质（DM）中含灰分3.02%、粗蛋白质（CP）9.24%、粗脂肪16.25%、中性洗涤纤维60.52%、酸性洗涤纤维51.77%。葡萄籽自然干燥后用中草药粉碎机粉碎过40 mm 筛孔，按0%、4%、8%、12%、16%、20%、24% 和28% 的比例分别添加至经粉碎过40 mm 筛孔的育肥羊全价配合饲料中。

1.3.1 体外产气试验 准确称取1.000 0 g 样品倒入产气瓶底部，每种饲料样品过40 mm 筛称3 个平行样，试验设空白对照3 个（空白对照不放饲料样品）。试验当天于晨饲前采集瘤胃液，采集的瘤胃液用4 层纱布过滤，残渣塞回瘤胃中，过滤后的瘤胃液装在温水预热的暖瓶中迅速带回试验室。人工唾液配制使用Menke 法[7]，人工唾液配制好后通入CO2，然后人工唾液和瘤胃液按2:1 比例混合成人工瘤胃液，每个产气瓶中倒入100 mL人工瘤胃液，在瓶口通入CO2，迅速盖上盖子，放到39℃恒温摇床中，连接体外产气监测系统（ANKOM，RFS 产气测量系统），记录时间频率设为0.5 h/次。

1.3.2 尼龙袋体外发酵试验 称取1.3 g 左右样品，装入孔径为50 μm，8 cm×6 cm 的尼龙袋中，系口后称重。将7 个时间点的21 个尼龙袋一次性投入4 L 的发酵罐内，每个时间点3 个平行样用尼龙绳系在一起，留线固定在瓶身外侧，便于取出。人工瘤胃液配制同体外产气试验，每个发酵罐中倒入1 000 mL 人工瘤胃液，瓶口通入CO2，迅速盖上盖子，放入39℃红外线加热、自动旋转的瘤胃体外模拟装置（ANKOM Daisy 自动体外培养箱）中，模拟瘤胃内环境及蠕动过程。在发酵后2、4、8、12、24、36、48 h 从发酵罐中快速取出尼龙袋，取样时通入CO2保持发酵罐内厌氧环境。

1.4 样品的采集及处理

1.4.1 体外产气试验样品采集及处理 发酵开始后第48小时停止试验，保存产气数据，将产气瓶快速放入冰水中，终止微生物活动，测定发酵液的pH，然后将产气瓶中的瘤胃液摇匀，取50 mL 瘤胃液于离心管中，1 500 ×g，39℃离心15 min，吸取4 mL 上清液于5 mL离心管中（预先加1 mL 1%的H2SO4溶液冷冻保存），用于测定氨态氮（NH3-N）浓度；取30 mL 上清液，用于测定菌体蛋白（MCP），所有样品均保存在-20℃冰箱中。

表1 育肥羊全价配合饲料日粮营养配方及营养成分（风干基础）

1.4.2 尼龙袋体外发酵试验样品采集及处理 在试验开始2、4、8、12、24、36、48 h 分别从每个发酵罐中取3 个尼龙袋，将尼龙袋在自来水下轻轻按压，冲洗干净，在65℃烘箱内烘12 h，烘干后回潮24 h，用于测定干物质降解率、粗蛋白质降解率。取尼龙袋同时测发酵液的pH，吸取4 mL 瘤胃液于5 mL 离心管中（预先加1 mL 1% 的H2SO4溶液冷冻保存），-20℃冷冻保存，用于测定NH3-N 浓度，取样过程要通入CO2保持厌氧环境。

1.5 样品测定 使用ANKOM RFS 体外产气监测系统记录产气量；发酵液pH 使用FiveEasy FE22 pH 计；发酵液NH3-N 浓度采用冯宗慈比色法[8]；饲料中CP 含量使用凯氏定氮法[9]；发酵液中MCP 含量使用凯氏定氮法，取30 mL 瘤胃上清液4℃ 21 000×g 离心20 min，留沉淀，用15 mL 生理盐水洗涤沉淀2 次，沉淀用10 mL 浓硫酸分3 次冲洗到消煮管中测定MCP 含量[10-11]。

1.6 统计分析

1.6.1 体外产气试验数据处理 根据ANKOM 体外产气监测系统数据表的压力值，换算成大气压下的产气量，得到的产气量减去空白对照的产气量。产气量计算公式：

GP=a+b×（1－e-ct）

式中，GP 为t 时刻的产气量（mL/g DM）；a 为快速产气部分产气量（mL/g DM）；b 慢速产气部分产气量（mL/g DM）；c 为产气速率（%/h）。

1.6.2 尼龙袋体外发酵试验数据处理 参照Øskov 等[12]提出的瘤胃动力学数学模型计算各时间点营养物质降解率和营养物质有效降解率，计算公式：

dP=a+b ×（1－e-ct）；

ED=a+bc/（k+c）。

式中，dP 为待测饲料的营养物质瘤胃某一时间点的降解率（%）；a 为快速降解部分含量（%）；b 为慢速降解部分含量（%）；c 为慢速降解部分的降解速率（%/h）；t 为瘤胃内培养时间（h）；ED 为有效降解率（%）；k为瘤胃外流速率，本试验中k 值取0.021%/h[13]。

营养物质在不同时间点的降解率计算公式：

A=100×（B－C）/B

式中，A 为待测饲料的所测营养物质物质某一时间点的消失率（%）；B 为待测样品中所测营养物质的含量（%）；C 为待测样品尼龙袋残渣中所测营养物质含量（%）。

利用SAS 9.2 的非线性（NLIN）方程对产气参数和降解参数进行分析，所有数据采用SAS 9.2 软件中的单因素方差分析进行显著性检验，LSD 多重比较差异，以P＜0.05 为差异显著性判断标准，结果用平均值和SEM 表示。

2 结果

2.1 添加不同比例的葡萄籽体外发酵48 h 的产气量 由表2 可知，在产气试验开始后的2、4、8、12 h，各组的产气总量随时间而增加，除24% 添加组2 h 产气量与对照组有显著差异外，其他各试验组2、4、8、12 h的产气量和0%组差异均不显著。随着葡萄籽添加比例的增长，各组12、24、36、48 h 的产气量先增长后减少，4%、8%、12% 和16% 添加组48 h 的潜在产气量差异不显著；16%添加组的潜在产气量显著高于各组，为121.03 mL/g。

表2 添加不同比例的葡萄籽体外发酵48 h 的产气量

2.2 添加不同比例的葡萄籽体外发酵48 h 各时间点的干物质降解率 如表3 所示，随着饲料在人工瘤胃液中发酵时间的增加，干物质的降解率增大；随着葡萄籽添加比例增加，各组的干物质降解率降低，0%添加组的干物质有效降解率显著高于16%、20%、24%组。

2.3 添加不同比例的葡萄籽体外发酵48 h 各时间点的粗蛋白质降解率 由表4 可见，各时间点的粗蛋白质降解率随着发酵时间的延长而增大；在发酵的2～24 h，各试验组的粗蛋白质降解率与0%添加组无显著差异。在发酵的36～48h，16%、20%和24%添加组粗蛋白降解率显著低于0%添加组，0%、4%、8%、12%添加组粗蛋白降解率差异不显著。16%、20% 和24% 添加组粗蛋白质48 h 有效降解率显著低于0%添加组。

2.4 添加不同比例的葡萄籽体外发酵各时间点的NH3-N、MCP 浓度及pH 表5 结果显示，体外发酵8～48 h 发酵液的NH3-N 浓度随着发酵时间的延长整体呈增长趋势。从表6 可以看出，16% 添加组的NH3-N浓度最低，显著低于0%添加组；随着葡萄籽添加比例的增加，发酵液中MCP 浓度整体呈下降趋势，12%、16%、20%、24%添加组MCP 浓度显著低于0%添加组。随着葡萄籽添加量的增加，发酵液pH 增高，除4%和8%添加组，各试验组的pH 显著高于0% 添加组。由图1可见，随着发酵时间的延长，发酵液的pH 降低，在发酵后的2～8 h，pH 降低速率较大。

3 讨 论

3.1 葡萄籽添加比例对全价日粮体外产气量的影响 碳水化合物和蛋白质在瘤胃中被微生物降解产生挥发性脂肪酸以及H2、CO2和甲烷等气体，饲料在瘤胃中的产气量能反映饲料被瘤胃微生物利用的程度。试验证明饲料营养物质的消化率与体外发酵的产气量有较高相关性[14]。米热古丽等[15]体外试验证实，葡萄籽精油能够显著提高发酵底物的总产气量；张力莉等[16]研究表明，随葡萄渣添加量的增加体外产气量上升；张雪峰等[17]在发酵底物中添加20%的葡萄籽，72 h 产气量显著高于对照组；Chikwanha 等[18]试验发现，随着日粮中葡萄渣比例的增加，羔羊45 d 平均日增重先增长后下降。本试验中添加不同比例葡萄籽后产气量先增长后减少，16%添加组48 h 的有效产气量最大，与前人研究规律一致，说明添加适量比例葡萄籽能促进底物被微生物利用，但当葡萄籽添加比例为20% 以上后产气量有一定程度的下降，说明添加过高比例的葡萄籽后，导致日粮中中性洗涤纤维与酸性洗涤纤维水平增加，改变了日粮的精粗比结构，从而影响了产气量[19]。葡萄籽中含有丰富的原花青素，利用铁盐催化比色法测定葡萄籽中原花青素含量为80～232 mg/g[20]。Rira 等[21]用3 种富含单宁的植物分别以25%、50% 和75% 的比例与干草混合，24 h体外产气量均降低，也可能是葡萄籽中单宁影响了瘤胃发酵模式。

表3 添加不同比例的葡萄籽体外发酵48 h 各时间点的干物质降解率 %

表4 添加不同比例的葡萄籽体外发酵48 h 各时间点的粗蛋白质降解率 %

表5 尼龙袋体外发酵8～48 h 的NH3-N 浓度 mg/100mL

表6 体外产气48h 发酵液中的pH、NH3-N 和MCP 浓度

图1 尼龙袋体外发酵48 h 各时间点的pH

3.2 葡萄籽添加比例对瘤胃干物质和粗蛋白质降解率的影响 饲料在瘤胃的降解主要是瘤胃微生物和微生物分泌酶作用的结果，饲料在瘤胃中的降解率是衡量饲料营养价值的重要指标。张力莉等[16]研究发现在体外试验中添加葡萄渣干物质消化率降低。本试验中随着葡萄籽添加比例的增加，饲料样品的干物质降解率下降。干物质降解率下降可能是因为葡萄籽中性洗涤纤维和酸性洗涤纤维含量较高（40%以上），添加葡萄籽使饲料中粗纤维含量升高，而纤维性饲料作为反刍动物饲料本就存在消化率低的特点[22]。

李会菊等[23]研究发现在绵羊日粮中添加16% 和24%的葡萄籽均显著降低粗蛋白质表观消化率；高新梅等[24]以瘤胃尼龙袋法测得TMR 日粮中添加4%以上的葡萄渣可以显著降低蛋白质有效降解率。Bruno-Soares等[25]在羽扇豆中添加不同量的葡萄籽提取单宁，蛋白质瘤胃降解率显著降低。杨凯[26]的研究结果表明，添加6.5、13.0、26.0 g/kg 单宁酸分别使蛋白质消化率降低5.0%、8.6%和15.7%。本试验添加16%以上的葡萄籽显著降低蛋白质有效降解率，与前人研究规律一致，可能是葡萄籽中含有丰富单宁降低了蛋白质降解率。单宁在植物中通常与植物蛋白质通过氢键结合为较稳定的单宁蛋白质化合物，使得蛋白质在瘤胃中的吸收受阻。尚凯宁等[27]研究表明，小麦蛋白中添加高粱单宁，小麦蛋白的体外消化率降低，电镜下可以观察到高粱单宁与小麦蛋白质络合形成难以被消化酶水解的络合物。

3.3 葡萄籽添加比例对瘤胃内环境的影响 微生物的种类决定瘤胃的发酵模式，瘤胃微生物的活性受pH 影响。瘤胃正常的pH 为5.50～7.00[28]，本试验中pH 在正常的发酵范围内。本试验发现，pH 随绵羊全价日粮中添加葡萄籽的比例增高而升高，但张雪峰等[17]研究发现，日粮中添加葡萄籽对瘤胃pH 无显著影响，但也有研究发现添加不同剂量葡萄籽精油提高发酵液的pH[15]。瘤胃氮代谢过程中外源蛋白质和内源含氮物质降解产生NH3-N。NH3-N 浓度可以反映饲料的降解和吸收程度。大量研究证明，瘤胃内NH3-N 的适宜浓度为6.3～27.5 mg/100mL[29]。菌体蛋白（MCP）是反刍动物重要的蛋白质氮源，NH3-N 也是瘤胃微生物合成（菌体蛋白）的原料，NH3-N 和菌体蛋白浓度具有较高的相关性，因此可以NH3-N 浓度推测瘤胃微生物合成作用的强弱[30]。Abarghuei 等[31]研究发现，日粮中加入葡萄渣会降低瘤胃液发酵液NH3-N 浓度；赵栋等[32]以连续动态人工瘤胃试验得出结果，添加14%～16%的葡萄渣显著降低瘤胃液NH3-N 浓度；刘洁等[20]试验中精粗比的降低也引起瘤胃了NH3-N 浓度的下降。本试验体外发酵48 h随着葡萄籽添加比例的增加发酵液中的NH3-N 浓度虽有波动但总体呈下降趋势，与前人研究结果一致，说明添加过高比例葡萄籽使瘤胃pH 升高、NH3-N 浓度降低，瘤胃细菌数量减少，间接地降低了瘤胃微生物利用NH3-N 合成瘤胃微生物蛋白的速率，最终降低了瘤胃MCP 产量。

4 结 论

本研究结果表明，全价日粮中添加8%～16% 的葡萄籽可以提高饲料的产气量，添加16% 以上的葡萄籽粗蛋白质有效降解率显著降低，瘤胃pH 升高，干物质降解率降低。从体外产气试验和体外发酵试验来看，绵羊日粮中葡萄籽的适宜添加比例为8%～12%。