稀硫酸预处理对甘蔗渣成分和酶解效率的影响①

刘 洋 胡小文 姚艳丽

(1 中国热带农业科学院湛江实验站 广东湛江524013;2 广东省旱作节水农业工程技术研究中心 广东湛江524013)

甘蔗是中国最大的制糖原料，南方蔗区甘蔗总产量7 000 多万t，每年产生的甘蔗渣产量约为2 000 多万t［1］。甘蔗渣是甘蔗榨糖后的产物，利用其生产燃料乙醇可以实现废弃物的再利用。甘蔗渣收集、运输简便，成本较低，因此利用甘蔗渣生产燃料乙醇具有广阔的发展前景［2］。和其他生物质原料一样，甘蔗渣成分主要包括半纤维素、纤维素、木质素、灰分等，由于甘蔗渣原料中的半纤维素、纤维素和木质素缠绕在一起，阻碍了半纤维素和纤维素与纤维素酶的接触，从而大大降低了酶解效率［3］，因此必须采取适当的预处理手段打破原有的晶体结构，增大酶和底物的接触面积，提高酶解能力。现有的预处理技术主要有物理法、化学法、生物法等［4］，其中稀硫酸处理是一种普遍采用的方法，其优点是稀硫酸可以将半纤维素彻底水解成单糖［5］。研究表明，甘蔗渣的半纤维素含量可达30%以上，因此用稀硫酸水解甘蔗渣可以得到更多的单糖，从而获得更多的乙醇［6］。前人的研究发现，在121℃条件下，0.25%～7.0%的稀硫酸浓度和15～240 min 预处理时间对甘蔗渣的水解效果有显著影响，可产生24.5 g/L的总糖［7］。而贾彦西［8］的研究发现，处理温度是影响还原糖转化效率的最关键因素，稀硫酸浓度、保温时间和固液比未见显著性影响。Cheng等［9］还提出了通过电渗析进行酸的再循环方法，此方法在一定程度上可以增加甘蔗渣中的还原糖产量以及酸的回收利用。为了进一步弄清稀硫酸浓度、温度、固液比和处理时间哪些条件是影响甘蔗渣预处理的关键因素，进而对甘蔗渣稀硫酸预处理条件进行进一步的优化，本文在前人研究的基础上，系统分析不同稀硫酸预处理条件对甘蔗渣成分、固液比、物理结构和酶解效率的影响，以期为今后开展甘蔗渣乙醇生产提供一些参考。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 实验材料

甘蔗渣来自湛江大华甘蔗制糖企业，在中国热带农业科学院湛江实验站实验室保存。

1.1.2 实验试剂

纤维素酶购自Solarbio 公司，柠檬酸、柠檬酸钠、3，5-二硝基水杨酸、酒石酸钾钠、稀硫酸、苯酚和无水亚硫酸氢钾购自上海麦克林公司，所用试剂均为分析纯。

1.1.3 实验仪器

FW100 泰斯特粉碎机（天津市泰斯特仪器有限公司）、723PCS 凤凰紫外可见分光光度计（上海凤凰光学科仪有限公司）、SHZ-DIII 予华牌循环水真空泵（巩义市予华仪器有限责任公司）、RU-T-15超纯水系统（上海同田仪器有限公司）、THZ-82 国立恒温气浴摇床（常州市国立试验设备研究所）、DHG-9123A 鼓风干燥箱（上海一恒科学仪器有限公司）、DS3200 普洛帝超声波振荡器（陕西普洛帝测控技术有限公司）、H1850R 湘仪冷冻离心机（湖南湘仪实验室仪器开发有限公司）。

1.2 方法

1.2.1 不同稀硫酸浓度处理

在100 mL 三角瓶中加入粒径0.425～0.850 mm的甘蔗渣粉末2.0 g，然后按1∶20（g/mL）的固液比分别加入浓度（V/V）为0.5%、1.0%、1.5%、2.0%、2.5%的稀硫酸溶液，使固体和液体充分混匀后在灭菌锅内120℃下反应30 min，冷却，中和，抽滤，然后将液体定容至100 mL容量瓶中，备用。

1.2.2 不同固液比处理

在100 mL 三角瓶中加入粒径0.425～0.850 mm的甘蔗渣粉末2.0 g，然后按固液比1∶10、1∶15、1∶20、1∶25、1∶30（g/mL）分别加入浓度（V/V）为2.0%的稀硫酸溶液，使固体和液体充分混匀后在灭菌锅内120℃下反应30 min，冷却，中和，抽滤，然后将液体定容至100 mL容量瓶中，备用。

1.2.3 处理温度

在100 mL 三角瓶中加入粒径0.425～0.850 mm的甘蔗渣粉末2.0 g，然后按1∶15（g/mL）的固液比分别加入浓度（V/V）为2.0%的稀硫酸溶液，使固体和液体充分混匀后在灭菌锅内105、110、115、120 和125℃的温度下反应30 min，冷却，中和，抽滤，然后将液体定容至100 mL 容量瓶中，备用。

1.2.4 处理时间

在100 mL 三角瓶中加入粒径0.425～0.850 mm的甘蔗渣粉末2.0 g，然后按1∶15（g/mL）的固液比分别加入浓度（V/V）为2.0%的稀硫酸溶液，使固体和液体充分混匀后在灭菌锅内120℃的温度下分别反应30、45、60、90、120 min，冷却，中和，抽滤，然后将液体定容至100 mL容量瓶中，备用。

1.2.5 样品水解液的总还原糖含量的测定

取适当稀释处理的滤液1 mL 于20 mL 比色管中，加入5 mL 去离子水，然后加入1.5 mL 的显色液，塞好盖摇匀，沸水浴5 min，取出流水冷却后用去离子水定容至20 mL，于540 nm 波长下测定吸光度，通过下列公式计算还原糖含量：

1.2.6 固体得率的测定

试样经稀硫酸处理后固体部分用蒸馏水冲洗至中性，用G3号砂芯漏斗抽滤，于105℃烘箱烘至恒重，计算其固体得率。

1.2.7 纤维素酶液制备

柠檬酸钠缓冲液0.05 mol/L pH 4.8 配制（分别配制A、B 液，然后按一定比例混合）参考贾彦西［8］的方法进行。

1.2.8 酶活性测定

酶活测定依照美国可再生能源实验室出版的方法《Measurement of Cellulase Activities》［10］和韦斌如［11］建立的pNPG 比色法。

还原糖浓度测定采用DNS法（3，5-二硝基水杨酸法）［12］。

1.2.9 甘蔗渣成分测定

甘蔗渣中半纤维、纤维素和木质素测定参考国际生物能源中心提供的方法《Determination of Structural Carbohydrates and Lignin in Bio‐mass》（2007-6-1）［13］，Klason木质素的测定参考国标GB/T 747—2003［14］。

上述实验设置对照（CK）均为未经过任何处理的甘蔗渣原料。

1.2.10 数据分析

实验数据利用SPSS 7.0软件中的单因素方差分析模块（ANOVA） 进行分析，p＜0.05 为显著性差异。

2 结果与分析

2.1 不同浓度稀硫酸处理对甘蔗渣主要成分的影响

不同浓度稀硫酸处理对半纤维素和纤维素影响较大，随着酸浓度的增加，半纤维素和纤维素含量逐渐降低，在稀硫酸浓度为0.5%时，半纤维素含量和纤维素含量均最高，分别为11.44%和60.9%；在稀硫酸浓度为2.5%时，半纤维素含量和纤维素含量分别下降到0.09%和40.25%。木质素含量随着硫酸浓度的增大基本保存不变（图1）。

不同温度处理对半纤维素和纤维素影响较大，当温度上升到125℃时，半纤维素和纤维素含量下降到最低，为1.62%和46.25%；在温度为105℃时，半纤维素和纤维素含量最高，为2.83%和50.23%；在105～125℃，温度的升高对半纤维素和纤维素的含量影响并不十分显著。随着温度的升高，木质素含量从14.02%下降到13.02%，但下降幅度不大（图2）。

相比稀硫酸浓度和温度，固液比对甘蔗渣半纤维素含量影响不明显，而对纤维素含量则呈先降低后升高的趋势。在固液比为1∶25时，半纤维素和纤维素含量最低，为1.6%和31.28%；在固液比为1∶15时，木质素含量最低，为12.58%。固液比为1∶10时，半纤维素含量、纤维素含量和木质素 含 量 均 最 高， 分 别 为8.97%、 52.35% 和14.45%（图3）。

随着处理时间的增加，纤维素含量和木质素含量均呈逐渐下降的趋势，处理时间从30 min 到120 min，半纤维素含量由15.5%下降到1.87%，木质素含量由14.02%下降到13.02%。纤维素含量在处理45 min后，基本保持不变，约49%（图4）。

2.2 不同稀硫酸处理对甘蔗渣物理结构的影响

对不同稀硫酸处理后的甘蔗渣物理结构进行电镜观察照相，结果表明：不同浓度稀硫酸、温度、固液比和处理时间对甘蔗渣物理结构都有不同程度的影响。没有经过稀硫酸处理的样品结构比较完整，原料表面平整光滑，纤维素排列整齐，没有出现小孔和裂缝（图5-A 和5-E）。而用1%或3%浓度的稀硫酸处理后，可清晰观察到蔗渣原料结构受到破坏，蔗渣内部结构变得疏松，蔗渣表面开始出现纤维碎片和小孔（图5-D 和5-H）。125℃处理甘蔗渣后也可以观察到甘蔗渣表面出现多个孔洞，甚至出现较大的缝隙，木质素和纤维素结构已基本破坏。不同固液比对甘蔗渣处理后甘蔗渣表面出现一定程度的破坏，但效果不明显，大部分结构还保持原状（图6-D）。固液比为1∶30时，甘蔗渣物理结构破坏较大（图7）。处理时间对甘蔗渣影响较大，处理120 min 后，甘蔗渣表面开始出小孔，进一步处理后，蔗渣表面变得凹凸不平，纤维素出现部分剥离，表面小孔增多（图8-H）。

2.3 不同稀硫酸处理对酶解效率的影响

利用不同预处理条件下的稀硫酸预处理甘蔗渣，实验结果如下：随着稀硫酸浓度的增加，原料表面可及表面积逐渐增加，降解效率也逐渐提高，还原糖质量分数逐渐增加；当稀硫酸浓度超过1.5%后，随着浓度增加，还原糖质量分数增加幅度略有放缓（图9-A）。所以，选择稀硫酸浓度为1.5%～2.5%。随着温度的升高，木质素和纤维素分离加快，还原糖含量也不断增加；当温度上升至115℃以后，糖含量增加趋势放缓（图9-B）。因此，选择温度范围为115～125℃。随着固液比的增加，还原糖质量分数先增加后趋于平稳，固液比为1∶10 到1∶15 时，还原糖质量分数增加比较明显，这是因为当固液比低于1∶10时，木质素不易被脱除，当增加到一定程度后，还原糖质量分数与固液比达到一个平衡点，因此最佳固液比为1∶20（图9-C）。上述结果表明，如果处理时间太短，木质素不能完全被稀硫酸脱除，水解效率将受到极大的影响；如果处理时间过长，纤维素部分容易被溶解而处理液中的糖含量减少。因此，考虑糖产量和节约时间的问题，处理时间90 min左右较为合理（图9-D）。

固体得率随着稀硫酸浓度、处理温度和处理时间逐渐下降，当下降到0.7左右时，下降速率明显变慢，最终趋于平缓（图10-A、9-B和9-C）。随着固液比的增高，固体得率先下降，当固液比为1∶20时，固体得率又有所上升（图10-D）。

3 结论与讨论

利用稀硫酸预处理甘蔗渣，不同的处理条件对甘蔗渣成分均存在一定程度的影响。随着稀硫酸浓度、温度和处理时间的增加，半纤维素、纤维素和木质素逐渐降低，因为用稀硫酸处理甘蔗渣时，酸可以破坏细胞壁，从而使半纤维素溶解，同时一部分木质素也遭到破坏分解成糖醛酸和乙酸酯，从而降低纤维素的结晶度。通过该方法，可以将甘蔗渣中的半纤维素和纤维素水解，同时还可以消化部分木质素［15-16］。稀硫酸的浓度和处理温度越高，处理时间越长，甘蔗渣物理结构破坏越严重，研究还表明，稀硫酸可以有效地降解木聚糖。因此，用稀硫酸处理甘蔗渣，不但可以提高纤维素酶的效率，还可以节省半纤维素酶的用量［17-18］。本研究还发现，稀硫酸浓度、处理时间和温度对甘蔗渣影响较大，但不同固液比对甘蔗渣成分影响没有明显的规律，表明固液比不是稀硫酸预处理甘蔗渣的关键因素。

使用稀硫酸预处理甘蔗渣后，甘蔗渣的物理结构破坏比较严重。综合来看，稀硫酸浓度、处理时间和温度对物理结构影响较大。这是因为在甘蔗渣中，半纤维素主要以粘合剂方式存在于细胞壁各薄层间，且分布在纤维细胞壁的次生壁外层，因而用稀硫酸处理后，半纤维素被水解，纤维细胞壁开始分层，原料表面随即变得粗糙并出现小孔［19］。进一步增加酶解的时间或者温度，蔗渣表面就会变得凹凸不平，纤维素开始剥离，表面小孔逐渐增多。但有些酶解后的原料残渣结构仍较完整，这是由于相比半纤维素来说，纤维素水解较为困难，酶解后的蔗渣仍含有较多未被水解的纤维素，它们与木素紧密连接在一起，很难被分离。

本研究发现，稀硫酸浓度和处理温度对固体得率影响较大，1.5%左右的稀硫酸浓度和125℃左右的处理温度，固体得率最低。当下降到0.7左右时，下降速率明显变慢，最终趋于平缓（图9-A）。这也说明，当稀硫酸浓度增高时，过量的稀硫酸对半纤维素和碳水化合物的损害作用增加，多余的稀硫酸还会使化学反应变慢，使固体得率趋于平稳。

和甘蔗渣成分相比较，酶解过程更为复杂，在较低的稀硫酸浓度、处理温度和处理时间，还原糖含量上升比较明显，但过高的稀硫酸浓度，预处理温度和时间都会阻碍酶解的进行。随着浓度增加，有效酸对碳水化合物的损害作用增加，多余的稀硫酸会使纤维素遭到破坏。当浓度上升至2.0%和温度上升到120℃以后，还原糖含量增加速率开始变慢。这是由于当浓度和温度升高到一定值时，糖开始变得不稳定，部分糖还会发生分解反应，生成糠醛等副产物，使还原糖质量分数增加变慢。

经过不同处理对甘蔗渣处理的结果，得出最佳的处理条件为：稀硫酸浓度2.0%，温度125℃，固液比1∶20，处理时间90 min。在这个条件下，甘蔗渣降解成还原糖的效率最高，还原糖浓度约在46%。