我国土壤微生物菌群构建防控香蕉枯萎病研究进展①

杜 浩 只佳增 李宗锴 周劲松 杨绍琼 陈伟强

(云南省红河热带农业科学研究所 云南河口661300)

香蕉枯萎病又称巴拿马病、黄叶病，属国际植物检疫对象，是由尖孢镰刀菌古巴专化型（Fusarium oxysporumf.sp.cubense，Foc）［1］侵染引起的一种毁灭性的真菌土传病害。该病我国自1960 年在广西发现，20 年间迅速传播至我国所有的香蕉主产区。2007 年香蕉枯萎病被我国列入进境植物检疫性有害生物名录［2］。目前，香蕉枯萎病的防治主要通过抗性品种选育、生物有机肥、化学防治、轮作种植等方法和措施进行。但还没有一种理想的防治药剂和防治方法来控制香蕉枯萎病，而生物防治方法虽起步较晚，但因其具有省工环保、生态高效等优点，逐渐发展成为公认比较安全和有效的防控香蕉枯萎病的措施之一［3］。而植物土传病害的生物防治在一定程度上依赖于调控土壤微生物群落及其功能多样性，土壤微生物群落结构越丰富，物种越均匀，多样性越高，对病原菌的综合抗性能力就越强［4］。

土壤微生物是土壤生态系统的重要组成部分［5］，它参与土壤中物质转换和能量流动，土壤中微生物的种类、数量和分布影响着土壤肥力、有机质分解、营养循环、植物生长及土壤中有毒物质降解等方面，其多样性也在一定程度上反映了土壤环境的质量。植物土传病害与土壤微生物群落之间有着密切的关系［6］。

目前研究土壤微生物组成和群落结构多样性的研究方法主要可分为3个层次［7］：一类是基于可培养微生物形态学和营养特征进行分离培养的方法，如平板稀释涂布法［8］；第2类是基于可培养微生物化学成分差异进行标记的方法，如脂肪酸谱图法［9］和醌指纹法［10］；另一类是基于微生物DNA的分子生物学技术，如高通量测序法［11］。国内关于香蕉枯萎病病区土壤微生物区系调控主要是通过施肥模式、轮作种植、拮抗微生物及化感植物运用等方面，本文从以上几方面总结近年来，尤其是近10 年来，关于土壤微生物区系调控及菌群构建防治香蕉枯萎病的理论基础，为以后开展相关研究提供参考。

1 病区土壤微生物区系特征

现有研究普遍认为，患病地土壤微生物群落及其功能多样性明显低于健康土壤。邓晓等［12］对香蕉枯萎病病区与非病区土壤微生物群落功能多样性进行了比较研究，发现患病样地土壤微生物群落功能多样性明显低于健康样地，而患病样地与健康样地土壤微生物的优势碳代谢群落基本相同，均为胺/氨基化合物代谢群和氨基酸代谢群。该研究团队还进一步研究了土壤理化性质、养分含量和可培养微生物群落结构与香蕉枯萎病之间的关系，结果表明，土壤pH 值是影响蕉园土壤微生物群落结构的主要因素；香蕉枯萎病危害程度中、重度土壤中可培养细菌和放线菌的种类及数量与危害程度轻度和无危害土壤相比均明显减少，而真菌种类没有明显的改变，数量却明显增加［13］。陈波等［14］对海南临高县3 个地区发病与健康土壤微生物的多样性进行分析，结果表明，发病蕉园土壤的大部分理化性质指标低于健康蕉园，且发病蕉园的土壤细菌多样性比健康土壤更丰富。黄永红等［15］研究了香蕉枯萎病4 号生理小种对香蕉根际土壤微生物和土壤酶活性的影响，结果表明，接种Foc4对香蕉根际土壤微生物总量和细菌数量影响不大，但显著提高了真菌数量及其在整个微生物中的比例，显著降低了放线菌数量及其在整个微生物中的比例，细菌与真菌、放线菌与真菌的数量比显著降低，根际土壤中过氧化氢酶和转化酶活性显著升高，这可能是香蕉通过改善其根际微环境来应对病菌侵染的重要自我保护机制。

相比于导病型土壤，抑病型土壤细菌及真菌的生态网络组织更复杂、网络节点之间联系更紧密，抑病型土壤中变形菌门（Proteobacteria）、酸杆菌（Gp4）、木霉属（Trichoderma）和假单胞菌属（Pseudomonas）的相对丰度显著高于导病型上壤，而镰刀菌属（Fusarium）的相对丰度显著低于导病型上壤［16］。黄珍等［17］研究认为镰刀菌导致的香蕉枯萎病的生态竞争中，变形菌门存在一定的劣势而厚壁菌门和放线菌门则能有效繁殖。陈波［6］对发病蕉园和健康蕉园根际土壤微生物群落进行了定性分析，发现病区主要优势菌为Cy‐tophagasp.、 Bacillus subtilis、 Staphylo‐coccus arlettae与Eubacterium ruminantium；而健康土壤优势菌为Bacillus subtilis、Bradyrhizobiumsp.、Rhodopseudomonas palus‐tris、Staphylococcus arlettae与Eubacterium ruminantium。

2 施肥模式调控

2.1 有机肥、生物肥和碱性肥料的应用

施肥模式调控土壤微生物区系主要是通过有机肥、生物肥、碱性肥料的施用及其几种肥料的联合运用等方面。应用生物有机肥可建立有益菌株改变根际菌群的主导微生物群落［18］，从而促进植物生长，减少病原菌数量或抑制土传病原菌活性［19］。赵兰凤等［20］研究了施用生物复混肥和化肥对香蕉枯萎病及土壤细菌群落多样性的影响发现，香蕉枯萎病的发生和化肥的施用都降低了土壤细菌群落多样性，而生物复混肥一定程度上提高了土壤细菌群落多样性。井涛等［21］研究了菜籽饼、豆饼和花生饼3种饼肥的不同碳氮比发酵液对香蕉枯萎病的防控效果，结果表明，施用饼肥发酵液可以促进植株生长，降低枯萎病病情指数，改变土壤微生物功能多样性，3 种饼肥发酵基质防病效果以菜籽饼最好，防病效果可达59.60%～67.25%。汪军等［22］研究了3 种复合微生物肥料对香蕉枯萎病发病率、香蕉生长指标及土壤微生物的影响，结果发现，施用复合微生物肥料不仅提高了对香蕉枯萎病的防治效果，而且对促进香蕉生长和提高根际的生防菌株数量具有较大潜力。李进等［23］研究碱性肥料对土壤微生物活性及其多样性的影响，认为施用碱性肥料能明显减少土壤中Foc和真菌数量，增加细菌、放线菌数量，显著优化土壤微生物种群结构，提高土壤微生物活性及其多样性，有效抑制病原菌的萌发和致病，从而有效防控香蕉枯萎病。樊小林等［24］利用碱性肥料调节香蕉园土壤酸度防控香蕉枯萎病结果表明，碱性肥料增产的原因在于：一方面提高了土壤pH 值而降低了香蕉枯萎病发病率及其病情指数，减少了香蕉的黄叶数量，使香蕉有较多的绿叶进行光合作用而高产；另一方面香蕉生长期土壤处于中性偏碱环境能有效地抑制尖孢镰刀菌的萌发和致病，而有利于其他有益微生物的生长，从而为香蕉健康生长营造良好的土壤环境。钟书堂等［25］连续两年在连作障碍严重的蕉园施用大量生物有机肥，发现其显著增加了土壤微生物碳量、可培养细菌、芽孢杆菌和放线菌的数量，减少了尖孢镰刀菌的数量并改良了可培养细菌的组成与群落结构，使连作土壤菌群朝着健康稳定的方向发展。

2.2 有机肥与功能微生物、化肥的联合作用

有机肥与功能微生物相结合制成微生物有机肥可最大限度的延长拮抗微生物的定殖状态和存活时间［26］，而生物有机肥与化肥的联合运用，可以在保障香蕉营养全面供给的同时防控病害。秦艳梅等［27］研究了生物有机肥与氯化钾和硫酸钾配施防治香蕉枯萎病的效果，结果发现，生物有机肥与钾肥配施促进了革兰氏阳性细菌和放线菌繁殖，而抑制了革兰氏阴性细菌和真菌生长。匡石滋等［28］研究发现，利用木霉菌和枯草芽胞杆菌与生物有机肥制成药肥两用生物有机肥施用能有效改善土壤微生物状况，增加土壤微生物种群数量，降低病原菌数量，抑制香蕉枯萎病病菌在土壤中的存活与繁殖，同时能提高相关防御性酶的活性，进而提高了植株的抗病性。张志红等［29］将枯草芽胞杆菌、胶质芽胞杆菌、巨大芽胞杆菌3种生防细菌与腐熟的有机肥结合，组合成生物复混肥和生物有机肥，结果发现，两种肥料的施用均引起了土壤微生物群落变化，即真菌数量明显下降，放线菌明显升高，细菌变化较小，防病效果分别达61.5%和53.8%。薛超［30］将Bacillus amyloliq‐uefaciens菌株发酵液与有机肥混合制成微生物有机肥后添加到土壤中，成功地在香蕉根际构建了一个有益功能微生物为主导的土壤微生物区系，这为土壤微生物菌群的构建提供了参考。

2.3 有机肥的防病机理

对于有机肥的防病机理，也有学者进行了相关研究。很多研究表明，氨基酸具有促进植物生长和改善土壤理化性质的作用，如刘卫军［31］研究发现，以氨基酸和多聚类化合物为主要成分的生防制剂能明显地增加土壤微生物多样性指数，降低香蕉枯萎病病情指数。赵兰凤等［32］也做了相关研究，发现生物有机肥降低了根系分泌物中有机酸的质量浓度，增加了氨基酸的种类和质量浓度，且香蕉枯萎病病情指数与根系分泌物中一些氨基酸质量浓度存在显著相关性，据此推测这可能是生物有机肥在香蕉枯萎病防治中起作用的原因之一。对于有机肥的最佳施用时期，丁文娟等［33］在大田条件下，研究了生物有机肥的不同施用时期对香蕉枯萎病和土壤微生物的影响，结果发现香蕉营养期施用防病效果最佳，施用生物有机肥显著降低了香蕉枯萎病的发病率，同时提高了土壤酶活性和增加了有益微生物数量。

3 轮作种植及植物化感调控

3.1 轮作种植运用

连作生物障碍的发生与根际微生态失衡有关。植物长期连作容易引起植物病原微生物的富集和有益微生物数量的减少，土壤微生物区系从细菌主导型向真菌主导型转化，最终导致土壤微生物组成与群落结构失衡，使病原菌更容易侵染植株而导致植物的各种土传病害频发［30］。许多研究证明，每种植物都有自己独特的根际微生物区系，而这些微生物区系直接或间接地影响其他土壤微生物的发生和发展［34］。所以利用轮作种植可以调控和改良一些土壤微生物区系，从而减轻病害的发生。

现有研究已证实，韭菜、木薯、水稻、生姜、甘蔗以及一些中草药类，通过粗提液、秸秆还田处理或直接与香蕉轮作的方式可有效减轻香蕉枯萎病的发生［35-37］。如欧阳娴等［34］研究了香蕉轮作和连作土壤细菌主要类群，发现韭菜轮作地的细菌多样性更为丰富，并且以拟杆菌门、变形菌门、放线菌门、绿湾菌门和酸杆菌门为主要类群；而香蕉连作地细菌多样性有所减少，且出现了明显的优势种群，以厚壁菌门、变形菌门、放线菌门和绿湾菌门为主要菌群。曾莉莎等［38］研究表明，土壤可培养细菌总数随轮作甘蔗年限的增加而显著增加，可培养放线菌总数和尖孢镰刀菌则呈逐渐减少的趋势，真菌总数无显著变化，土壤细菌多样性指数随轮作甘蔗年限的增加而降低；假单胞菌目（Pseudomonadales）、酸微菌目（Acidi‐microbiales）、浮 霉 菌 目（Planctomycetales）和土壤红杆菌目（Solirubrobacterales）的细菌丰度随甘蔗种植年限增加而呈逐年增加的趋势，并与香蕉枯萎病发病率呈显著负相关；红螺菌目（Rhodospirillales）、酸杆菌目（Acidobacte‐riales）和军团菌目（Legionellales）的细菌丰度则呈随甘蔗种植年限逐年降低趋势，并与香蕉枯萎病发病率呈显著正相关。柳红娟等［39］发现，木薯与香蕉轮作可显著降低总真菌数量、病原菌数量和枯萎病的发生率，显著增加可培养放线菌数量、总细菌的数量、可培养微生物的B/F值和A/F值及总B/F值。

3.2 植物化感运用

植物粗提取液作为潜在的植物源生物农药在植物病害的防控中有广泛的应用。前人研究结果显示，部分植物粗提取液可有效抑制真菌及细菌的生长［40］，这种作用机制称之为植物的化感作用。漆艳香等［41］研究了油麦菜和向日葵全株水提液对香蕉枯萎病及土壤中微生物的影响，发现向日葵和油麦菜处理均能显著提高土壤中细菌数量，显著减少放线菌、Foc4和普通真菌数量，且防病效果与土壤中Foc4及普通真菌呈显著正相关，与细菌及放线菌则呈显著负相关。杨江舟等［42］研究了韭菜根系浸提液对香蕉枯萎病和土壤微生态的影响，认为韭菜根系浸提液能够提高土壤微生物对碳源的利用能力和土壤微生物群落的多样性、丰富度、均匀度，从而减少香蕉枯萎病的发生。穆雷等［43］利用韭菜、大蒜、大葱、洋葱等4 种葱科植物的组织粗提液进行Foc拮抗试验发现，韭菜的抑菌效果最佳，其次为大蒜和大葱，与对照相比都达到了差异极显著水平，但洋葱粗提液的抑菌效果不明显。柳红娟等［44］研究发现木薯茎叶还田能显著增加土壤中可培养放线菌、总细菌数量，显著降低可培养真菌、总真菌及香蕉枯萎病菌的数量，增加可培养微生物的B/F值和A/F值。

4 拮抗菌调控

已报道的对尖孢镰刀菌具有拮抗作用的拮抗细菌主要包括荧光假单胞菌（Pseudomonas flu‐orescens）、粘质沙雷氏菌（Serratia marce‐scens）、枯草芽孢杆菌（Bacillus subtilis）、荚壳伯克氏菌（Burkholderia glume）、铜绿假单胞菌（P. aeruginosa）等；拮抗真菌有哈茨木霉（Trichoderma harzianum）、非致病性F. oxys‐porum菌株、无孢菌群真菌等［45］。而关于运用拮抗菌调控土壤微生物区系，李琳［46］研究了解淀粉芽孢杆菌（Bacillus amyloliquefaciens） AiL3 菌株对香蕉根际及根内微生物种群的影响，生防菌AiL3 施入大田后，通过平板计数法分析得出，AiL3 菌株主要影响香蕉根际土壤微生物的数量，对根内生微生物的数量影响不大；而PCR-DGGE 技术分析结果显示，菌株处理后田间香蕉根内生微生物群落结构有较大的变化，孕蕾期根部内生细菌的种类减少，而对香蕉根际土壤微生物的种类无显著影响。樊胜南等［47］研究了枯草芽孢杆菌TR21 可湿性粉剂施用对香蕉根际土壤微生物的影响发现随着时间的推移，处理和对照根际土壤微生物丰度值都逐渐升高，多样性指数值逐渐降低，但处理的根际土壤物种丰度值一直都大于对照。漆艳香等［41］研究了洋葱伯克霍尔德氏菌（Burk‐holderia cepacia，TY） 和 解 淀 粉 芽 孢 杆 菌（Bacillus amyloliquefaciens，DF）对香蕉枯萎病的防效及土壤中微生物群落的影响，发现二者均能显著提高土壤中细菌数量，显著减少放线菌、Foc4 和普通真菌数量。杜婵娟等［48］研究了木霉制剂对土壤微生物数量和香蕉枯萎病的影响，结果表明，蕉园施入木霉制剂后，香蕉根围土壤中真菌的数量显著提高，枯萎病的发病率明显降低，处理区最高防效达63.5%。

5 抗性品种调控

抗病品种培育被认为是最有效的防控香蕉枯萎病的手段之一［49］，近年来众多研究人员对不同品种对香蕉枯萎病的抗性进行了大量评价研究［50-52］，也筛选出了较多抗性较好的品种，如南天黄［53］、粉杂1 号［54］、GCTCV-119［55］等。而对于抗病品种的抗性机理，其对土壤微生态环境的影响，田丹丹等［56］从根系分泌物的角度出发，分析了不同香蕉品种的抗性机理，初步推测抗性品种的根系分泌物吸引了更多有益微生物到香蕉根际，这些有益微生物通过拮抗作用、重寄生作用、竞争作用、促生作用和诱导抗性等机制来抵抗香蕉枯萎病病原菌。张曼等［7］对不同品种的土壤微生物区系群落结构和多样性进行了探究，结果发现抗病品种真菌丰富度低于感病品种，细菌丰富度和多样性髙于感病品种；在真菌水平上，抗病品种根际和土壤环境中接合菌门（Zygomycota）和担子菌门（Basidiomycota）的相对丰度较高，子囊菌门（Ascomycota）的相对丰度较低；在细菌水平上，抗病品种根际和土壤环境中拟杆菌门（Bacteroidetes）、厚壁菌门（Firmicutes）和放线菌门（Actinobacteria）的相对丰度较高，纤维杆菌门（Fibrobacteres）和绿弯菌门（Chlo‐roflexi）相对丰度较低；而抗病品种的土体和根际镰刀菌均和感病品种没有显著差异。邓晓等［57］研究了不同感病级别植株土壤微生物区系特征，结果表明，根际与非根际土壤中可培养真菌、细菌、放线菌的数量和种类均从感病级别高、感病级别低到健康植株持续增加，而病原菌数量从感病级别高、感病级别低到健康植株持续降低。韩李菲［58］研究发现，抗病品种土壤中可培养细菌和放线菌的数量基本上比感病品种多，而感病品种根系土壤中病原菌Foc 的数量基本显著高于抗病品种。

6 其他调控

土壤微生物区系的调控还包括土壤熏蒸、灌溉水消毒处理等措施。钟书堂等［25］研究了氨水、石灰碳铵熏蒸土壤对土壤微生物群落的影响，结果表明两种熏蒸剂对土壤中可培养总细菌和总真菌均有杀灭效果，随着用量的增加，总真菌数量下降幅度显著高于总细菌；同时浓度筛选试验发现，2.67 mL/kg 氨水和（3.33±1.67）g/kg 石灰碳铵联用既能有效杀灭尖孢镰刀菌，又能够最大维持微生物区系稳定性，为香蕉土壤熏蒸的最适用量。王一鸣等［59］也做了相关研究发现，石灰联合碳铵土壤熏蒸处理明显改变了香蕉根际微生物群落结构，即显著降低变形菌门和子囊菌门相对丰度，显著增加放线菌门相对丰度；同时显著降低镰刀菌属相对丰度，并且显著提高了土壤中部分拮抗菌的相对丰度，如链霉菌属、红球菌属和曲霉属，最终有效防控香蕉枯萎病的发生并促进其植株生长。刘珊珊等［60］利用灌溉水消毒研究了其对香蕉植株生长和可培养微生物数量的影响，发现灌溉水消毒改变了香蕉根际可培养微生物群落结构，能够显著减缓病原菌在土壤中传播和在香蕉根际的富集。此外，江琳琳［61］开展了不同酸碱度土壤中施加生物炭梯度试验，结果发现生物炭能够提高土壤微生物丰度和多样性，改变土壤细菌种群分布，进而影响土壤微生物的碳源代谢特征，引发土壤系统功能的改变。叶文雨等［62］研究了巨菌草和绿洲一号两种菌草的根际土壤细菌群落多样性发现，2 种菌草的根际土壤细菌群落的多样性与丰富度均略高于非根际土壤，且绿洲一号根际土壤细菌群落多样性略高于巨菌草，并据此推论不同植物根系对根际土壤细菌群落影响不同，根系分泌物是影响根际细菌群落的重要因素。笔者思考，生物炭调控和菌草运用在香蕉枯萎病的土壤微生防技术探索中是否具有可借鉴性呢？总之，这些土壤微生境的调控方式均为土壤微生物区系调控与构建防治香蕉枯萎病提供了新的思路和依据。

7 展望

土壤健康是指在生态系统界限内维持生物生产力、环境质量和促进动植物健康的土壤功能运行能力［63］，而利用微生物及其代谢产物、植物提取物等生物农药防治植物病害，使用对生态环境无害的生防菌剂替代化学农药已成为世界范围内的研究发展方向［64］。所以试图利用基于土壤微生物区系调控的生防方案，从土壤酶活性和土壤微生物组成与群落结构调控的角度防治香蕉枯萎病具有可行性，我国学者通过对香蕉枯萎病病区土壤微生物区系特征研究，同时利用拮抗菌、有机肥、植物提取物等尝试调控土壤微生物生境朝着促进有益菌共生和抑制病原菌繁殖的目标转变，构建稳定健康的土壤微生态区系，取得了较多理论基础。但由于土壤微生态环境的复杂性和地域的多变性，国内外关于尖孢镰刀菌枯萎病抑病型土壤的研究均不够深入，且推进缓慢［65］。

现阶段，关于生防菌的研究主要集中于平板对峙试验阶段，对大田应用的可行性和防效评估研究较少。生防菌剂为活孢子制剂，大田应用受到田间温度、湿度、pH、土壤微生物、化学农药等因素的干扰［66］。因此应调控适合生防菌生长的土壤环境，提高其在土壤中的营养利用率和定殖水平，使其快速占据生态位点和分泌能有效抑制病原菌的代谢产物，从而降低土壤中尖孢镰刀菌数量，这是控制香蕉枯萎病的有效途径［22］。此外，单一拮抗菌株的防治效果不稳定，所以，应加强对现有拮抗菌联合运用研究，即通过平板对峙试验及在大田应用中筛选出能够共生增效的拮抗菌群体系［67］，如Rajeswari P 等［68］比较了绿木霉+荧光假单胞菌（1%＋2%）、哈茨木霉+荧光假单胞菌（1.5%＋2%）和绿木霉＋哈茨木霉（1%＋1.5%）3个组合对Foc的抑制效果发现，绿木霉＋荧光假单胞菌的组合显著优于另外两个组合，这就为开展拮抗菌的联合运用提供了很好借鉴。再者，现有研究中，对轮作作物的研究缺乏经济效益评估，选择轮作的作物除考虑防病效果外，应充分考虑土壤养分利用状况、投入产出比等［69-70］；植物化感作用的研究往往局限于在培养基中添加某种植物提取物，研究其对病原菌的荧光猝灭率，缺乏田间应用技术研发。

最后，土壤微生物区系调控及其菌群构建为香蕉枯萎病的防控提供了新的思路，但土壤微生态坏境的调控需要栽培、植保、育种等措施来干预，要在香蕉枯萎病生防技术上不断取得突破，或许不能仅通过某一单一防治方法来实现，而应该是多种途径的结合应用。如柳影［71］等研究发现，施用生物有机肥联合韭菜套作对枯萎病的防效为45.2%明显高于单独运用生物有机肥的18.7%和单独运用韭菜套作的13.6%。李虹等［72］研究发现，香蕉与豆科植物间作，同时施加钙镁调理剂、微生物菌肥和有机肥，提高了土壤pH，增加了土壤中细菌数量，并抑制了镰刀菌和真菌群落数量，这都是生防技术联合运用的成功探索。对于土壤微生物菌群的调控与构建方向，Schippers B 等［73］研究表明，健康土壤中细菌占主要地位，放线菌能通过分泌抗生素来减缓其他菌的生长，真菌大部分是病原菌，而对于香蕉枯萎病的防治，香蕉根际土壤微生物菌群的构建是否完全符合这一论点，还有待更多研究加以补充。但基于土壤微生态菌群健康稳定区系的构建和生防技术研发或将是实现香蕉枯萎病可持续治理的有效途径。