TIPE3抑制CDDP诱导宫颈癌SiHa细胞凋亡及其机制研究①

姜召玲 王 洋 杨明浩 姜 杰 (烟台通华医院检验科，烟台 264099)

TIPE(tumor necrosis factor alpha-induced protein 8,TNFAIP8)基因家族共有4个成员:TIPE、TIPE1、TIPE2与TIPE3，各成员间具有较高的同源性，在肿瘤及炎症性疾病中发挥重要作用[1]。已有研究表明TIPE3作为癌基因在肿瘤的发生发展中起到促进肿瘤增殖及转移的作用[2]。但到目前为止，TIPE3在宫颈癌中的生物学功能及其在宫颈癌治疗中的作用尚不清楚。

宫颈癌在女性癌症发病率中高居第四位，是女性癌症主要死亡原因之一，也是最常见的女性生殖道恶性肿瘤[3]，鉴于我国宫颈癌高发病率及高死亡率的特点，发现新型治疗靶点刻不容缓。目前宫颈癌的治疗以手术、放疗及新型辅助化疗为主，顺铂(cis-diamminedichloroplatinum,CDDP)作为临床治疗常用化疗药物在宫颈癌的化学治疗中发挥关键作用，但其耐药性逐年增多[4]，找到导致其耐药的靶向基因将为宫颈癌的化学治疗提供有力手段。本研究旨在发现TIPE3抑制宫颈癌化疗敏感性及其可能机制。

1 材料与方法

1.1材料

1.1.1细胞株和慢病毒载体 人宫颈癌细胞系SiHa购自中国科学院上海细胞库，细胞培养条件如下：培养基为含10%胎牛血清(FBS)的MEM，在37℃，5%CO2气体条件恒湿培养。TIPE3慢病毒及干扰载体均购自上海吉凯基因化学技术有限公司，分装并保存于-80℃超低温冰箱备用。

1.1.2仪器与试剂 Aria2流式细胞仪购自美国BD公司，多功能酶标仪购自赛默飞有限公司(Vario skan Flash,Thermo,USA)；CCK8检测试剂盒(C0037)及Annexin V-PI凋亡检测试剂盒(C1052)购自上海碧云天科技有限公司；蛋白印迹使用PVDF膜购自美国Millipore有限公司；ECL显影液购自Thermo fisher公司；顺铂(CDDP)购自齐鲁制药有限公司;MDR1抗体购自Bio-Legend公司(SIG-38730,Bio-Legend,San Diego,CA)；IL-6抗体购自Abcam公司(Ab9324);IL-6 ELISA检测试剂盒购自南京森贝伽生物科技有限公司(SBJ-H0465)。

1.2方法

1.2.1RT-PCR检测MDR1表达 利用Trizol试剂盒 (Invitrogen)对细胞总RNA进行提取，逆转录成cDNA后，PCR (TIANGEN,Beijing,China)检测mRNA表达水平。引物序列如下:h-TIPE3,上游5′-GAGGAGCTGGTTATTGTGGAGAA-3′，下游5′-ATC-GGCAAAGTGGTTAAAGACG-3′;h-MDR1,上游5′-GAGGAATCTGGAGGAAGACATGACC-3′ ，下游5′-TCCAATTTTGTCACCAATTCC-3′;h-GAPDH,上游5′-AACGGATTTGGTCGTATTGGG-3′，下游 5′-CCTGGAAGATGGTGATGGGAT-3′。

1.2.2Annexin V/FITC和PI双染法检测CDDP诱导的细胞凋亡 人宫颈癌细胞系SiHa培养于含10%FBS的MEM培养基中，待细胞汇合度达80%时，用含EDTA浓度0.25%胰酶消化细胞，以密度1×106个/孔接种于6孔板中，待细胞贴壁后进行TIPE3过表达或干扰慢病毒转染，24 h后加入50 μmol/L浓度的CDDP继续作用24 h。检测前用不含EDTA的胰酶消化细胞，PBS离心洗涤2次，Annexin V/FITC和PI双染试剂盒进行标记染色，避光孵育15 min后，流式细胞仪上机检测，实验重复3次。

1.2.3Western blot实验 接种于6孔板的人宫颈癌系SiHa培养于含10%FBS的MEM培养基中，待细胞汇合度达80%时，转入TIPE3慢病毒载体及阴性对照，50 μmol/L浓度的CDDP继续作用24 h后用含RIPA的蛋白裂解液提取细胞总蛋白，冰上裂解30 min，低温高速离心去除沉淀，上清检测蛋白浓度。蛋白样品经垂直电泳、转膜、封闭环节后，最后与TIPE3抗体、MDR-1抗体及IL-6抗体4℃孵育12 h，TBST洗膜3次，加入ECL显影液进行胶片曝光检测蛋白表达量，以GAPDH作为内参，实验重复3次。

1.2.4ELISA实验 收集细胞培养上清1 500 r/min离心20 min以彻底去除可能影响检测的杂质，取上清50 μl进行ELISA实验，并设阳性对照及阴性对照及空白对照孔。具体实验步骤参照试剂说明书，最后用多功能酶标仪在吸光度450 nm处进行读数，读取各孔OD值；绘制标准曲线，计算培养上清中IL-6的浓度。

1.3统计学方法 采用Graphpad Prism7.0.软件(GraphPad Software,San Diego,CA)进行t检验分析，P<0.05表示差异有统计学意义。

2 结果

2.1TIPE3使宫颈癌细胞系SiHa IC50值明显升高 宫颈癌细胞系SiHa转入TIPE3过表达慢病毒载体及对照载体，以5×103个/孔细胞密度接种于96孔板中，待细胞贴壁后，各孔依次加入CDDP (浓度从0依次递增至300 μmol/L)，继续培养24 h，使用CCK-8试剂盒在OD450处测量该细胞对CDDP的IC50值(半数致死量)。IC50值计算方法为：(1-药物处理细胞OD450/未处理细胞的OD450)×100%，使用GraphPad Prism 7.0计算CDDP的IC50值。结果发现转染TIPE3过表达慢病毒的宫颈癌细胞系SiHa，经CDDP作用24 h后，其IC50值与对照组相比显著增加，表明TIPE3对CDDP诱导的宫颈癌细胞凋亡有明显抑制作用，差异具有统计学意义(图1，P<0.001)。

2.2TIPE3抑制CDDP诱导的宫颈癌细胞系SiHa凋亡 基于上述结果，为进一步明确TIPE3在CDDP诱导宫颈癌细胞凋亡中的作用，TIPE3过表达宫颈癌细胞及对照组细胞以1×106细胞密度接种于6孔板中，待细胞贴壁后，加入50 μmol/L的CDDP处理24 h。用不含EDTA的胰酶常规消化细胞，用PBS以1 000 r/min速度离心洗涤细胞2次，Annexin V/FITC和PI双染试剂盒进行标记染色后，流式细胞仪检测细胞凋亡情况。结果如图2A显示，与空白组(Blank)及转染空载体组(Control)相比，TIPE3可显著抑制CDDP诱导的宫颈癌细胞凋亡，差异具有显著统计学意义(图2A，P<0.001)。 同时，本课题组用TIPE3干扰慢病毒转染宫颈癌细胞系SiHa，旨在从反向多水平检测TIPE3在该现象中的作用。结果如图2B所示，转染TIPE3干扰慢病毒后，SiHa细胞在CDDP的诱导下凋亡明显增多(图2B，P<0.001)，以上结果进一步表明TIPE3可抑制CDDP诱导的宫颈癌细胞系SiHa凋亡。

图1 TIPE3显著增加SiHa细胞的IC50值Fig.1 TIPE3 significantly increases IC50 value for SiHa cells

图2 TIPE3显著抑制CDDP诱导的SiHa细胞凋亡Fig.2 TIPE3 significantly inhibits CDDP-induced SiHa cell apoptosisNote:***.P<0.001.

图3 TIPE3显著上调宫颈癌细胞中MDR1的表达水平Fig.3 TIPE3 significantly up-regulates MDR1 expression in cervical cancer cellsNote: ***.P<0.001.

2.3TIPE3明显上调宫颈癌细胞中MDR1的表达 MDR1(P-gp)是导致肿瘤耐药的主要分子之一，其功能主要是使抗肿瘤药物外排增加，是多药耐药(multi drug resistance,MDR)形成的主要因素。如图3所示，本研究发现过表达TIPE3后，与空白组(Blank)及转染空载体组(Control)相比，不管是mRNA(图3A)还是蛋白水平(图3B)，宫颈癌细胞中MDR1表达量皆明显上调。本课题组用TIPE3干扰慢病毒转染宫颈癌细胞系SiHa，结果如图3所示，转染TIPE3干扰慢病毒后，SiHa细胞中MDR1mRNA(图3C)及蛋白表达量皆明显下调(图3D)， 以上结果表明TIPE3可使MDR1蛋白表达升高，从而导致肿瘤耐药的发生(P<0.001)。

图4 TIPE3显著上调宫颈癌细胞中IL-6的表达水平Fig.4 TIPE3 significantly up-regulation of IL-6 level in cervical cancer cellsNote: ***.P<0.001.

2.4TIPE3明显上调宫颈癌细胞IL-6水平 有研究表明IL-6作为一种细胞因子参与了多种癌症进展的过程，包括肿瘤生长、转移和微环境免疫调节等[5]。有趣的是IL-6的过度表达可导致肿瘤细胞产生获得性耐药，表明针对IL-6的治疗靶点可能成为逆转肿瘤耐药的新型策略[6]。本研究发现过表达TIPE3后，与空白组(Blank)及转染空载体组(Control)相比，宫颈癌细胞培养上清(图4A)及肿瘤细胞中(图4B)IL-6表达量皆明显上调。转染TIPE3干扰慢病毒后，SiHa细胞培养上清(图4C)及肿瘤细胞中(图4D)IL-6表达水平则明显下调。 以上结果表明TIPE3可使IL-6表达升高，进而也参与了肿瘤耐药的发生过程(P<0.001)。

3 讨论

多药耐药基因1(MDR1)编码P-glycoprotein(又称为ATP结合盒转运蛋白B1，ABCB1)，该基因位于染色体7q21上[7]。 人类ABC转运蛋白的一些成员如MDR1的主要功能是将各种化学治疗药物加速从肿瘤细胞泵出，从而赋予肿瘤细胞多药耐药(MDR)现象[8]。 尽管MDR1(P-gp蛋白)在肾脏、肝脏及胎盘等正常组织中皆有表达，但它在耐药肿瘤中显著过量表达，从而导致抗癌药物无效和多药耐药的产生[9,10]。

TIPE3是最近发现的TIPE家族成员之一，目前对其功能的研究较少，它在人宫颈癌、结肠癌、肺癌和食道癌中的表达显著增加，并且主要在分泌性上皮组织中表达[2,11]。机制上，它主要增强PI3K信号传导和下游Akt信号传导，敲低TIPE3会显著减少动物模型中的肿瘤发生，过表达则会增加肿瘤发生，表明它在肿瘤生物学行为中行使癌基因功能[2]。在人类胶质母细胞瘤中，TIPE3抑制p38磷酸化并阻断p38核转位，通过调节p38 MAPK途径并导致胶质母细胞瘤细胞存活[12]。有研究认为NF-κB和MAPK-ERK途径与MDR1的表达调控密切相关[13]，因此我们认为TIPE3可能在肿瘤耐药中也发挥重要功能。

本研究中，我们首次发现过表达TIPE3的宫颈癌细胞系SiHa对CDDP敏感性降低，主要表现为IC50值升高，该现象说明TIPE3可以抑制化疗药物对宫颈癌细胞的杀伤作用。Annexin V和PI实验进一步发现过表达TIPE3后，肿瘤细胞对CDDP诱导的细胞凋亡率明显降低。机制上，本课题组发现TIPE3可激活MDR1的转录表达，MDR1(P-gp)的主要功能是使肿瘤细胞中的抗肿瘤药物外排增加[14]，从而导致化疗药物活性下降，是导致多药耐药的主要原因[15]。更有意思的是，我们发现过表达TIPE3后不管是细胞培养上清还是肿瘤细胞中IL-6水平皆明显上调。IL-6是一种促炎症细胞因子，通过整合多种细胞内信号通路参与多种生理和病理过程。IL-6的异常表达与多种肿瘤的生长、转移和化疗耐药有关[16]。在过去几十年中，尽管与诊断和治疗方式有关的技术取得了显著进展，但死于癌症相关疾病的人数并没有显著减少。一般认为，肿瘤细胞释放到微环境中的某些分泌因子除了促进肿瘤生长外，还具有使肿瘤细胞对化疗和放疗产生抵抗的能力。IL-6是肿瘤微环境中重要的细胞因子之一，在肿瘤耐药中发挥关键作用[17]。本研究中发现TIPE3上调IL-6水平的现象，表明阻断IL-6或抑制其相关信号通路或与常规抗癌治疗相结合可能成为治疗癌症的潜在策略。

为进一步明确TIPE3在CDDP诱导宫颈癌细胞凋亡中的机制，本课题组用TIPE3干扰慢病毒转染宫颈癌细胞系SiHa，旨在从反向多水平检测TIPE3在该现象中的作用。结果显示转染TIPE3干扰慢病毒后，SiHa细胞在CDDP的诱导下凋亡明显增多，MDR1及IL-6表达水平则明显下调。该结果进一步表明TIPE3可使MDR1及IL-6表达增多，进而抑制CDDP诱导的宫颈癌细胞凋亡。 尽管目前宫颈癌的治疗采用了联合治疗方法，但尚未得到满意的临床效果，本课题组前期发现TIPE也参与宫颈癌的发生发展过程[18]，因此现阶段需要找到更多有效的参与因素，以改善患者治疗效果。已有文献发现TIPE3作为癌基因在人宫颈癌肿瘤组织中的表达显著增加[2]，提示其在宫颈癌的发生发展中将发挥重要功能。本研究发现TIPE3在宫颈癌化学治疗中发挥重要作用，为后续以TIPE3作为治疗靶点，将对宫颈癌的诊断和治疗、逆转肿瘤多药耐药提供了理论可能和实践基础。