李佳瑞 田志刚 彭 慧 (中国科学技术大学免疫学研究所,合肥 230027)
自然杀伤(natural killer,NK)细胞是固有免疫系统的重要组成部分,其在抵御病原微生物感染和肿瘤免疫监视中发挥至关重要的作用。与T、B淋巴细胞不同,NK细胞无须预先被抗原致敏便可快速活化,通过强大细胞毒效应直接杀伤被感染的靶细胞或肿瘤细胞,可在适应性免疫应答启动之前,保护机体免受病原体的感染[1]。NK细胞的活化是一个动态平衡过程,其功能状态受到位于膜表面的多种活化性或抑制性受体的调控,同时也依赖多种细胞因子的调节[2,3]。NK细胞活化后,释放大量穿孔素和颗粒酶直接杀伤靶细胞,或分泌多种细胞因子调节免疫应答,例如,NK细胞释放大量IFN-γ和TNF-α招募淋巴细胞浸润至感染部位并增强免疫应答,并诱导树突状细胞(dendritic cells,DCs)的成熟,但在慢性炎症中也可分泌IL-10以减弱T细胞、巨噬细胞的活化[4,5]。因此,NK细胞在固有免疫和适应性免疫应答过程中都具有非常强大的功能。
NK细胞是异质性的细胞群体。近年来,我们及其他研究团队发现表面分子CD49a和CD49b(DX5)能将肝脏NK细胞划分为比例和数目相近的两个亚群,其中CD49a-CD49b+NK细胞为参与外周血液循环的经典NK(conventional NK,cNK)细胞,而CD49a+CD49b-NK细胞则选择性驻留于肝窦中,我们将其定义为肝脏驻留NK(liver-resident NK,LrNK)细胞[6,7]。随后,科研人员在皮肤、子宫、肠道、脂肪和唾液腺等许多非淋巴组织中陆续发现了组织驻留NK(tissue-resident NK,trNK)细胞,这些新亚群的发现使我们对固有淋巴细胞(innate lymphoid cells,ILCs)家族乃至整个免疫系统有了新的认识[8-17]。
1.1LrNK细胞的发现 肝脏是天然免疫优势器官,与机体的新陈代谢和免疫稳态密切相关[18]。肝脏具有双重血供,20%血供来自于肝动脉,其余均由收集消化道静脉血液的门静脉血液提供,门静脉血液携带大量来自胃肠道的微生物及其代谢产物、食物小分子、环境毒素至肝脏。肝窦是位于肝板结构之间的蜂巢状细小血管,动脉和静脉血汇聚于此并通过中央静脉流出肝脏[19]。肝窦含有丰富的淋巴细胞(如NK细胞、NKT细胞、T细胞)和大量非淋巴细胞(如肝实质细胞、肝脏星形细胞和肝窦内皮细胞等)[20]。血液在肝窦中流速缓慢,肝内免疫细胞与血液充分接触而暴露于大量抗原之中,免疫细胞对有害病原体发生应答,对无害抗原保持耐受,从而维持肝脏稳态[21]。NK细胞在肝脏中富集,约占人肝脏总淋巴细胞的25%~40%,因此,肝脏特有NK细胞逐渐引起关注[22-24]。
早期研究发现,胚胎期小鼠肝脏有一群比例很高、表型不成熟的TRAIL+CD49b-NK细胞,其在小鼠出生后仍特异性维持于肝脏之中,提示肝脏存在不同的NK细胞亚群[25,26]。在此研究基础之上,我们发现肝脏CD49b+NK细胞和CD49b-NK细胞基因表达谱存在显著差异,包括活化性或抑制性受体、细胞因子、转录因子和毒性效应分子等,其中,CD49a在肝脏CD49b-NK细胞上选择性表达,而在CD49b+NK细胞上几乎不表达。转输实验证明肝脏CD49a+CD49b-NK细胞表型稳定,是不同于胸腺NK细胞或cNK细胞的特殊亚群[6,7,27,28]。
LrNK细胞和cNK细胞在诸多方面存在差异。LrNK细胞具有组织特异性,呈现不成熟且高度活化的表型特征,其高表达CD49a、TRAIL、CD69,低表达NK细胞成熟相关分子如CD49b、CD11b、Ly49受体家族等[6]。cNK细胞高表达T-box家族转录因子T-bet和Eomes,而LrNK细胞呈T-bet+Eomes-[7]。LrNK细胞脱颗粒能力弱于cNK细胞,但其高表达杀伤相关功能分子穿孔素和粒酶B,提示其具备潜在的杀伤能力,同时分泌炎症因子如IFN-γ、TNF-α和GM-CSF[6,7,11]。此外,LrNK细胞表达免疫记忆相关分子CXCR6和CD127(IL-7Rα),在接触性超敏反应和病毒感染模型中,能介导独立于T、B淋巴细胞的半抗原特异的免疫记忆应答[6,29-34]。
1.2人LrNK细胞的发现 人NK细胞可根据细胞表面CD56的表达情况分为CD56dim和CD56bright两个群体,其中外周血NK细胞以CD56dim为主。人肝脏组织富含CD56brightCD16-CD57-NK细胞,但仅有少量CD56brightNK细胞表达CD49a,CD56brightCD49a+NK细胞高表达T-bet而低表达Eomes,但其占肝脏总NK细胞的比例较低且在人群中波动较大[35]。CXCR6将人肝脏NK细胞划分为比例相近的两个亚群,CXCR6+NK细胞具有组织驻留淋巴细胞的表型特征,人外周血NK细胞则以CXCR6-为主。因此,CXCR6可能作为人和小鼠LrNK细胞的通用标志[36]。但与小鼠LrNK细胞不同的是,人肝脏CXCR6+NK细胞的细胞毒效应分子和细胞因子的分泌水平较低,并且呈现T-betlowEomeshigh,人外周血NK细胞则为T-bethighEomeslow[36]。T-bet和Eomes作为区分LrNK细胞和cNK细胞的两个特征转录因子,它们在小鼠和人NK细胞亚群的表达模式上呈明显的种属差异[37,38]。此外,CD49e-NK细胞也被报道在人肝脏中特异性富集,该亚群可能和CXCR6+NK细胞存在重叠[39]。以上研究证实人和小鼠LrNK细胞具有不完全相同的特征。
2.1LrNK细胞的发育分化路径 绝大部分NK细胞起源于具有自我更新及维持能力的骨髓造血干细胞(hemopoietic stem cells,HSCs)[40,41]。共同淋巴祖细胞(common lymphoid progenitors,CLPs)位于HSC下游,CLP是淋巴细胞发育早期的重要节点,受到Notch信号的调控并具有发育成T细胞、B细胞、ILCs的潜能,CLP表型定义为Lin-IL-7Rα+c-KitintSca-1intFlt3high[42-44]。CLP获得α4β7和CXCR6的表达后,成为共同固有淋巴祖细胞(common innate lymphoid progenitors,CILPs)并失去向T、B细胞分化的潜能[45,46]。CILP产生分化潜能不同的NK祖细胞(NK progenitors,NKPs)和共同辅助样固有淋巴祖细胞(common helper innate lymphoid progenitors,CHILPs)。NKP分化为cNK细胞,而CHILP最终分化为包括LrNK细胞在内的ILC1、ILC2、ILC3以及淋巴组织诱导(lymphoid tissue inducer,LTi)细胞,因此,LrNK细胞和cNK细胞发育路径不同[46-49]。
CD122(IL-2Rβ)作为IL-15受体复合物的组成部分,使NKP接受IL-15信号得以存活和增殖,因而CD122被视作NKP的标志分子。早期研究将NKP表型定义为Lin-CD122+NK1.1-CD49b-[50],但其与OP9-DL1基质细胞体外共培养后也能产生T细胞,说明此NKP具有分化为NK细胞和T细胞的双向潜能[51]。随后,NKP进一步被划分为Lin-CD27+CD122-IL-7Rα+Flt3-CD244+的pre-NKP(pre-NK progenitors)和Lin-CD27+CD122+IL-7Rα+Flt3-CD244+的rNKP(refined-NK progenitors),它们都仅向NK细胞定向分化[48,52]。由于上述关于NKP表型鉴定的研究是在trNK细胞和其他ILCs被发现之前开展的,pre-NKP和rNKP是否具有向trNK细胞和其他ILCs分化的潜能尚需进一步研究。NKP的下游分化过程伴随着表型变化,产生不成熟NK (immature NK,iNK)细胞和成熟NK(mature NK,mNK)细胞。NK1.1和NKG2A/CD94最早获得表达,NKp46、Ly49受体、CD49b、CD11b、CD43、KLRG1等逐渐获得表达,同时下调CD51、CD27、CXCR3[47,53]。CD49b可表征NK细胞的成熟状态,iNK细胞表型定义为Lin-CD49b-NK1.1+CD122+,mNK细胞表型定义为Lin-CD49b+NK1.1+CD122+[26]。此外,CD27和CD11b也能划分不同成熟阶段的NK细胞[54]。
2.2参与调控LrNK细胞发育分化的转录因子 LrNK细胞和cNK细胞的发育过程受到不同组合转录因子的调控(图1)[55]。NK细胞高表达Nfil3(E4bp4),其作用于IL-15信号下游,与NK细胞发育分化密切相关[56,57]。Nfil3在NK细胞发育早期发挥关键作用,调控Eomes、Id2多种转录因子的表达[58-60]。特异性敲除NKp46+NK细胞的Nfil3并不影响NK细胞的存活与功能,说明NK细胞的晚期成熟不完全依赖Nfil3[61]。Nfil3缺陷导致cNK细胞几乎缺失,而包括LrNK细胞在内的特定组织trNK细胞所受影响较小,说明cNK细胞更加依赖Nfil3[7,11]。此外,转录因子Tox、Ets1、Tcf-1对NK细胞发育早期阶段也很重要[43,44,62,63]。
图1 小鼠ILC的发育路径Fig.1 Development of innate lymphoid cells(ILCs)in miceNote: HSCs differentiate into a a series of developmental intermediates,which finally give rise to different ILC subsets.Downstream of HSCs,CLPs further differentiate into CILPs that can generate NKPs and CHILPs under the regulation of different transcriptional factors.NKPs exclusively produce cNK cells,while CHILPs differentiate into LTi cells via the LTi progenitor(LTiP)stage,or differentiate into ILCPs that possess ILC1,ILC2 and ILC3 potential.Nfil3(nuclear factor IL-3 induced),Id2(inhibitor of DNA binding 2),Tox(thymocyte selection-associated high mobility group box protein),Tcf-1(T cell factor 1),Ets1(avian erythroblastosis virus E26 homolog-1),Gata3(GATA binding protein 3),PLZF(promyelocytic leukemia zinc finger),T-bet(T-box transcription factor),Eomes(Eomesodermin),Rorα(RAR-related orphan receptor α),Rorγt(RAR-related orphan receptor γt),Ahr(Aryl hydrocarbon receptor)
ILCs各亚群的发育都受到Id2的调控作用,其参与调控CILP、CHILP、NKP的产生[64,65]。表达Id2、Gata3的CHILP具有发育成为LrNK细胞和其他ILCs以及LTi细胞的潜能,但不能发育成为cNK细胞[65,66]。PLZF是Id2的潜在靶基因,PD-1+PLZF+CHILP进一步分化产生ILCs,LrNK细胞和黏膜ILC1s依赖T-bet的调控并分泌Th1型细胞因子IFN-γ,由于它们的发育路径十分相近,因此LrNK细胞也被称为肝脏ILC1s[11,67,68]。
T-bet和Eomes对NK细胞发育晚期阶段十分关键,它们对NKP向成熟NK细胞分化是必需的,若二者同时缺失则无法产生正常的NK细胞,NKP数量不受影响而iNK和mNK细胞显著减少。LrNK细胞严格依赖T-bet而非Eomes,T-bet缺陷导致LrNK细胞大幅减少[38,69]。此外,Hobit和Blimp1参与调控具有组织驻留特性的淋巴细胞的发育,Hobit缺陷导致LrNK细胞显著减少而对cNK细胞几乎无影响[70-72]。
微环境的外源性因子能诱导NK细胞表型或功能发生改变,如直接影响NK细胞的活化、效应分子的表达及细胞毒效应。IL-2和IL-15在NK细胞发育、增殖和活化中发挥重要作用[73]。IL-12和IL-18促进NK细胞表达IFN-γ和TNF-α,NK细胞在IL-12/15/18协同刺激可迅速活化并发挥强大的细胞毒效应,在二次刺激时相对初次接受刺激的NK细胞具有更强大的功能效应。因此,使用IL-12/15/18协同刺激预先活化NK细胞也被视作癌症治疗的新思路[74]。此外,LrNK细胞与cNK细胞都依赖IL-15而非IL-7,IL-7缺陷使ILC2、ILC3大量减少但ILC1和cNK细胞基本不受影响,IL-15缺陷则导致相反结果,因此,对IL-15的依赖性是区分group 1 ILCs与其他ILCs的重要依据之一[38,46]。
已有研究证实,NK细胞在肿瘤微环境中具有可塑性,CD49a-CD49b+Eomes+cNK细胞在TGF-β信号诱导下转变为中间阶段CD49a+CD49b+Eomes+ILC1(intILC1)和CD49a+CD49b-Eomesint ILC1,其上调表达抑制性受体CTLA-4、LAG3及NKG2A和促血管生成相关基因PSGF-AB,并且分泌大量TNF-α和GM-CSF,cNK细胞的数量和功能都显著下降,最终导致肿瘤逃脱固有免疫系统的监视。但肿瘤ILC1胞内TGF-β受体下游经典信号通路的活性并未增强,可能是非经典的TGF-β信号诱导NK细胞转变,如SMAD4表达被抑制所导致的非经典的TGF-β信号诱导NK细胞向ILC1转化[75-77]。与依赖TGF-β信号的肿瘤ILC1类似,TGF-β对于维持唾液腺中CD49a+ILC1的表型及存活十分重要[15]。另外,TGF-β影响NK细胞内DAP12和 mTOR的活性,使NK细胞抗肿瘤能力下降[78-80]。以上研究提示TGF-β在NK细胞的可塑性和功能方面具有重要影响。
IFN-γ既是NK细胞的重要效应分子,也能影响其发育和功能,IFN-γ缺陷小鼠肝脏的NK细胞显著减少,且无法正常应答PolyI:C的刺激[81]。而脾脏等其他脏器NK细胞数量不受影响,提示IFN-γ信号可能主要影响LrNK细胞而非cNK细胞。Ahr在小鼠LrNK细胞和人组织驻留的CD56brightNK细胞内组成性高表达,Ahr-/-小鼠的LrNK细胞比例和数量显著下降,Ahr缺陷使LrNK细胞快速扩增、耗竭并凋亡,说明LrNK细胞内源性依赖Ahr,该依赖性可能与肝脏双重血供及其微环境相关[82,83]。稳态下的Ahr与分子伴侣结合形成复合物游离胞浆之中,当其结合细胞内源性或外源性配体后转移至细胞核中调控基因转录。Ahr外源性配体多是来自环境中的食物小分子和微生物代谢物,如黄豆来源的异黄酮、十字花科蔬菜来源的异硫氰酸盐、弓形虫催化产生的脂氧素A4或由莽草酸途径合成的芳香族化合物等[84,85]。因此,肝脏门静脉血液中含有大量Ahr的潜在配体,LrNK细胞内Ahr易被活化,但目前尚不清楚该配体的具体来源和组成。
骨髓造血干细胞是成年个体造血的主要来源,而胚胎发育期间主要依靠卵黄囊(yolk sac,YS)、主动脉-性腺-中肾(aorta-gonad-mesonephros,AGM)区域和胎肝(fetal Liver,FL)发挥造血功能,直至个体出生后才逐渐被骨髓代替为主要的造血器官[86,87](图2)。卵黄囊较早发挥造血功能,E7.0(embryo,7.0)天在小鼠胚胎卵黄囊最早出现造血祖细胞,包括原始红系祖细胞和巨核巨噬前体细胞[88,89]。E8.25天卵黄囊出现红系髓系祖细胞(erythromyel-oid progenitors,EMPs)和淋巴系髓系祖细胞(lympho-myeloid progenitors,LMPs),同时胚胎心脏开始跳动,卵黄囊周围发生血管重塑使造血祖细胞进入血液循环并在E9.5天到达胎肝[90,91]。另外,E8.5天在主动脉旁胚脏壁(Para-aortic splanchnopleure,P-Sp)和AGM区域最早出现HSC及其前体,于 E10.5天到达胎肝并进一步分化为pre-HSC(pre-hematopoietic stem cells,pre-HSCs)和mHSC(mature hematopoietic stem cells,mHSCs)[92]。因此,卵黄囊造血系统对于胚胎早期生长至关重要[93]。胎肝于E11.5天开始成为主要的造血部位,多种造血祖细胞快速分化成熟并大量扩增,而脾脏和骨髓则分别在E13天和E15天发育成为造血器官,骨髓成为个体出生后的主要造血器官,但肝脏、脾脏仍保留一定造血潜能[94]。
图2 小鼠NK细胞的个体发生Fig.2 Ontogeny of NK cells in miceNote: Embryonic yolk sac(YS)is the initial site of hematopoiesis during ontogeny.Hematopoietic progenitors(HP)and erythromyeloid pro-genitors (EMP) first appear in the YS and migrate to fetal liver(FL).Then,HSC precursors from AGM migrate to the FL,which becomes the major site of hematopoiesis during fetal life.Mature NK cells(mNK)gradually emerge in the FL,spleen,peripheral blood and thymus at different time points.
目前认为NK细胞都起源于造血干细胞,然而骨髓移植小鼠LrNK细胞的比例和数量低于正常小鼠,提示骨髓仅具有部分产生LrNK细胞的能力。将骨髓细胞和肝脏单个核细胞分别转输后都能维持受者鼠的存活,说明肝脏单个核细胞中包含造血祖细胞。骨髓嵌合实验也证明肝脏可能具有LrNK细胞的直接前体细胞,而骨髓造血干细胞倾向分化为cNK细胞,以上发现提示LrNK细胞可能来源于胚胎时期便存在于肝脏中且能自我更新的造血祖细胞,肝脏微环境支持其存活[6]。近年来发现组织驻留的巨噬细胞和肥大细胞起源于卵黄囊的EMP[95,96]。LrNK细胞是否也可能来自EMP而独立于骨髓造血系统之外?还需进行深入研究。
NK细胞在胎肝中的发育早于骨髓和外周。胎肝于E13.5天开始出现NKP(Lin-CD122+NK1.1+CD49b-),而E14.5天外周血最早出现NKP并在E18.5天才逐渐增多。胎肝中的iNK细胞和mNK细胞分别在E14.5天和E15.5天出现,并在E16.5天出现具有杀伤功能的NK细胞,这一发育过程早于外周,说明最早在胎肝出现NK谱系并通过血液循环迁往其他部位[51]。
近十年来,关于NK细胞的区域免疫学特性研究越来越多。小鼠CD49a+CD49b-LrNK细胞的发现为固有免疫研究打开新的篇章,非淋巴组织特有的ILCs逐渐受到关注[6,7,97]。LrNK细胞具有潜在的杀伤能力,并且分泌大量IFN-γ、TNF-α和GM-CSF等炎症细胞因子调节免疫应答[11]。人肝脏中也存在与外周血NK细胞显著不同的NK细胞亚群,但人LrNK细胞的表型界定仍存在争议[35]。本文讨论了起源于HSC的多种固有淋巴细胞的发育过程,包括cNK细胞、LrNK细胞和其他ILCs[40]。LrNK细胞与cNK细胞在发育分化和转录调控上存在显著差异,它们具有不同的发育路径并受不同组合转录因子的调控,其上游祖细胞分别是 CHILP和NKP,LrNK细胞依赖PLZF、Hobit、T-bet,而cNK细胞需要Nfil3、Ets1、Eomes[38,69]。微环境因素也对NK细胞产生影响,如TGF-β诱导cNK细胞向ILC1转化。LrNK细胞和cNK细胞的个体发生过程存在差异,胚胎和新生小鼠肝脏NK细胞绝大部分为LrNK细胞,个体出生后cNK细胞才逐渐增多[26]。
在NK细胞发育分化过程中,pre-NKP和rNKP部分表达PLZF,提示NKP与ILCP分化路径之间可能存在某一阶段的重叠[98],NKP是否也能分化为LrNK细胞?组织微环境与NK细胞的发育和塑造密切相关,目前还不清楚在肝脏微环境中对LrNK细胞发育分化中起关键作用的因素[24,76,81,82]。此外,LrNK细胞和cNK细胞的起源仍存在疑问,尽管已经证实成年小鼠肝脏中存在自我维持并更新的造血祖细胞,其可能直接分化成为LrNK细胞,但我们对其知之甚少[6]。胚胎期卵黄囊造血系统支持胚胎的存活并发挥早期造血功能,皮肤、肺脏和肝脏驻留的巨噬细胞以及脂肪组织、胸膜腔内驻留的肥大细胞都起源于卵黄囊的EMP,那么同样具有驻留特性的LrNK细胞是否也可能起源于胚胎发育早期的造血祖细胞而独立于骨髓造血系统之外?关于LrNK细胞的起源需进一步深入探究。