人参皂苷Rg1对K562细胞增殖的影响

韩艳军，王翠丽，刘小虎，周 玥

（大理大学基础医学院，云南大理 671000）

白血病是一种造血系统的恶性肿瘤，目前化疗是治疗白血病的主要手段，但化疗药物的副作用大，复发率高，对人体机能有极大的损害。某些天然药物具有抗白血病细胞而对正常细胞损伤小的优点，因此，从祖国医学宝库中寻找抑制白血病细胞恶性增殖的中药是值得探索的途径之一〔1〕。人参为五加科植物人参（Panax ginseng C.A.Mey.）的干燥根和茎，收载于《中华人民共和国药典》，性微温，味甘、微苦，归脾、肺、心经，具有大补元气、复脉固脱、补脾益肺、生津养血、安神益智之功效，人参对白血病有一定的疗效〔2〕。其中人参皂苷Rg1是人参的主要药理活性成分〔3〕，对肿瘤细胞的增殖有明显抑制作用并能诱导其分化〔4〕。本实验以慢性粒细胞白血病细胞株K562为研究对象，探讨人参皂苷Rg1对K562细胞增殖的影响，并筛选出人参皂苷Rg1对K562最佳的作用时间及浓度，为后续研究人参皂苷Rg1在治疗白血病中起到的作用及相关机制提供研究思路和实验数据。

1 材料与仪器

1.1实验材料与试剂K562细胞购自齐式生物科技有限公司；RPMI 1640培养基（HyClone公司）；胎牛血清（BI公司）；PBS（磷酸缓冲盐溶液，赛默飞公司）；PI（碘化丙啶，BD公司）；人参皂苷Rg1（大连美仑生物有限公司）；CCK-8试剂盒（碧云天生物技术有限公司）；细胞周期与凋亡检测试剂盒（美国BD公司）；96孔板和24孔板（COSTAR公司）。

1.2实验仪器电热压力蒸汽消毒器（上海博讯实业有限公司）；超净工作台（苏州安泰空气技术有限公司）；二氧化碳培养箱（日本三洋sanyo）；低速台式离心机（上海安亭科学仪器厂）；多功能酶标仪（Thermo Fisher）；流式细胞仪（美国BD公司）；倒置显微镜（Nikon）；移液器（Eppendorf）；细胞计数板（上海医用仪器厂）。

2 实验方法

2.1细胞培养用RPMI 1640培养基（含10%胎牛血清）于37℃、5%CO2饱和湿度条件下培养K562细胞，每天更换培养液，每隔2～3 d传代并冻存，取对数生长期的K562细胞进行后续试验。

2.2 K562细胞增殖取对数生长期的K562细胞，按1×105个/mL的浓度接种于96孔板中，每孔100μL。分别加入不同浓度（5、10、20、40、80μmol/L）的人参皂苷Rg1，每孔10μL，每个浓度设5个复孔。另设空白对照组（不加药物）。置于37℃、5%CO2饱和湿度条件下培养。分别培养24、48和72 h后，加入CCK-8，每孔10μL，继续培养4 h，经酶标仪检测A450值，并按下式计算细胞增殖抑制率。细胞增殖抑制率（%）=［（空白对照组A450平均值-各实验组A450平均值）/空白对照组A450平均值］×100%，该实验重复3次。

2.3 K562细胞集落形成实验取对数生长期的K562细胞，按500个/mL的浓度接种于24孔板中，每孔500μL。分别加入不同浓度（5、10、20、40、80 μmol/L）的人参皂苷Rg1，每孔50μL，每个浓度设4个复孔。另设空白对照组（不加药物）。置于37℃、5%CO2的饱和湿度培养箱中培养。培养7 d后记录K562白血病细胞集落数，并计算集落形成率和抑制率。细胞集落形成率（%）=平均细胞集落数/每孔中加入的细胞数×100%，抑制率（%）=［（空白对照组集落数-实验组集落数）/空白对照组集落数］×100%，以大于50个细胞的聚合为一个K562细胞集落。该实验重复3次。

2.4 K562细胞周期检测取对数生长期的K562细胞，按1×105个/mL的浓度分别接种于两个培养瓶中，每瓶5 mL，分别标记为空白对照组和人参皂苷Rg1组。在空白对照组和人参皂苷Rg1组中分别加入PBS和20μmol/L的人参皂苷Rg1，每瓶500μL。处理细胞48 h后，离心收集细胞，弃上清，预冷PBS洗涤3次，加入1 mL预冷70%乙醇混匀，在4℃下固定过夜，离心收集细胞，洗涤，用PBS重悬细胞。加入PI染色液，每组500μL，37℃避光温浴30 min。最后在激发波长为488 nm处上流式细胞仪检测细胞周期。该实验重复3次。

2.5数据处理采用SPSS 20.0软件进行数据分析，计量资料以（）表示，实验组与空白对照组比较采用单因素方差分析（One-way ANOVA），方差齐时进一步两两比较采用LSD-q检验，方差不齐时用Dennett's检验。以P＜0.05为差异有统计学意义。

3 实验结果

3.1人参皂苷Rg1对K562细胞增殖的影响经过人参皂苷Rg1分别处理24、48、72 h后，5、10、20、40、80μmol/L的人参皂苷Rg1处理组对K562细胞的抑制率分别见表1。当人参皂苷Rg1浓度为20μmol/L，作用时间为48 h时K562细胞增殖抑制率最高，为（24.5±0.2）%。

表1 人参皂苷Rg1对K562细胞增殖的影响

表1 人参皂苷Rg1对K562细胞增殖的影响

注：与空白对照组比较*P＜0.001。

3.2人参皂苷Rg1对K562细胞集落的影响经过浓度为5、10、20、40、80μmol/L的人参皂苷Rg1分别处理，培养7 d后K562细胞的集落数、集落形成率、集落抑制率分别见表2。当人参皂苷Rg1浓度为20μmol/L，K562细胞的集落数最少，为（354.0±6.2）个；集落形成率最低，为（70.8±1.2）%；集落抑制率最高，为（22.7±1.5）%。集落图像见图1。

3.3人参皂苷Rg1对K562细胞周期的影响经过浓度为20μmol/L的人参皂苷Rg1处理48 h后，细胞周期的改变见表3。与空白对照组比较，加药组细胞周期发生明显改变，阻滞在G0/G1期的细胞变多，为（76.3±2.6）%；S期和G2/M期的细胞变少，分别为（8.3±1.4）%和（15.4±1.5）%。细胞周期流式图见图2。

图1 集落图像（×100）

表2 人参皂苷Rg1对K562细胞集落的影响s，n=3）

表2 人参皂苷Rg1对K562细胞集落的影响s，n=3）

注：与空白对照组比较*P＜0.05，**P＜0.001。

表3 人参皂苷Rg1对K562细胞周期的影响±s，n=3）

表3 人参皂苷Rg1对K562细胞周期的影响±s，n=3）

注：与空白对照组比较*P＜0.05，**P＜0.001。

4 讨论

图2 细胞周期流式图（PI染色）

K562细胞是人类慢性髓系白血病细胞，常常用于研究肿瘤和白血病的治疗及探寻药物靶标等领域。慢性粒细胞白血病（chronic myelogenous leukemia，CML）是一类由造血干细胞恶性克隆形成的疾病，白血病细胞因自我更新增强、增殖失控、分化障碍及凋亡受阻而停滞在细胞发育的不同阶段，增殖失控是其典型特征，从而使正常造血功能受到抑制并逐渐浸润骨髓及其临近组织，最终导致骨髓造血功能受损，白血病是一类造血干细胞的恶性克隆性疾病〔5-6〕。CML的传统治疗包括化疗和骨髓移植，两者都给患者带来了相当大的经济和心理负担，化疗副作用强，特异性差，而骨髓移植供体稀少，价格昂贵。因此，继续研究CML的新型治疗方法非常重要〔7-8〕。

人参皂苷Rg1可在一定浓度范围内呈剂量-效应关系的抑制K562细胞增殖，以作用48 h时抑制作用最强〔9〕。研究报道，40μg/mL的人参皂苷Rg1处理MG-63人骨肉瘤细胞后细胞增殖抑制率最高〔10〕，50μmol/L的人参皂苷Rg1处理HL-60细胞后细胞增殖抑制率最高〔11〕。由此可知，人参皂苷Rg1对不同细胞株增殖抑制的最适浓度不同。本研究对人参皂苷Rg1进行了体外抗肿瘤活性的初步研究，结果显示：人参皂苷Rg1浓度为20μmol/L时，作用48 h，对K562细胞的增殖抑制作用最明显，K562细胞的集落数最少，集落形成率最低，集落抑制率最高。集落数目的多少取决于细胞的活力强弱，集落形成率降低意味着细胞活力的减弱。本研究中人参皂苷抑制K562细胞增殖，降低细胞的活力，使得细胞集落形成减少。CCK-8法的主要研究对象是细胞群，而集落形成实验的主要研究对象是原始细胞，因此，CCK-8法与集落形成实验相结合能够更全面、更客观地观察和分析人参皂苷Rg1对K562细胞增殖的抑制作用。说明人参皂苷Rg1能够抑制K562细胞增殖，具有体外抗肿瘤活性。

细胞增殖通常与细胞周期密不可分，细胞增殖是通过细胞周期的正常运行来实现的。有研究表明，细胞周期变化与肿瘤的发生发展密切相关〔12〕。正常细胞周期中存在周期调节控制点，而癌细胞可以无限增殖正是由于癌细胞对周期控制点的调节失去了控制，如果药物能恢复周期控制点的作用，导致细胞不能得到增殖，就能达到抑制癌细胞增殖的作用〔13〕。其中G1期已经成为多种抗肿瘤药物的作用靶点〔9〕。流式细胞术结果显示K562细胞周期发生明显改变，阻滞在G0/G1期的细胞变多，S期和G2/M期的细胞变少。G0/G1期时细胞为不再增殖细胞，对肿瘤增长没有作用，阻滞在该期的细胞所占数量越多，肿瘤的恶性程度越低，细胞的增殖变慢〔14〕。由此可知人参皂苷Rg1可能起到了恢复周期调节控制点的作用，通过将K562细胞阻滞在G0/G1期，破坏细胞周期，降低肿瘤恶性程度，来抑制细胞增殖。

白血病的出现是由于多种基因的非正常表达，诱导细胞的凋亡抑制与过速增殖。因此，探索临床治疗白血病的方法多通过控制和预防癌细胞的过速增殖及加速其凋亡来实现。本文通过探讨人参皂苷Rg1对K562细胞增殖的作用，得出人参皂苷Rg1可能通过将K562细胞阻滞在G0/G1期来抑制细胞增殖的结论。为进一步探讨人参皂苷Rg1在白血病中起到的生物学作用、潜在靶点及相关机制提供数据，奠定理论基础。但是人参皂苷Rg1可能通过调节细胞周期抑制K562增殖的具体机制及信号通路目前尚不清楚，还有待进一步研究与阐明。