HPLC-ELSD同时测定鲜竹沥中单糖 双糖的含量△

赵雯，洪挺，游媛，罗跃华，付辉政

江西省药品检验检测研究院 江西省药品与医疗器械质量工程技术研究中心，江西 南昌 330029

鲜竹沥为禾本科植物粉绿竹Phyllostachysviridi-glaucescens(Carr.) A. et C. Riv.、净竹PhyllostachysnudaMcClure及同属的数种植物的鲜杆经加热后自然沥出的液体，煮沸后加适量防腐剂制得，具有清热化痰之功效，用于肺热咳嗽痰多、气喘胸闷、中风舌强、痰涎壅盛、小儿痰热惊风等症，为治疗肺热咳嗽的要药[1-2]，也是用于治疗痰热咳嗽等常见呼吸病症中药大品种鲜竹沥、复方鲜竹沥液的主要原料药，涉及23家单方鲜竹沥生产企业和10家复方鲜竹沥液生产企业。鲜竹沥主要含有愈创木酚、氨基酸、木脂素、无机元素、酚酸、糖等类成分[3-8]。熊艳等[9]采用柱前衍生HPLC比较了传统烧制法和回流提取法2种方法制备的淡竹沥中游离氨基酸含量，结果回流提取法所得游离氨基酸总量较烧制法高出近12倍。李红等[10]采用紫外-分光光度法测定了竹沥中总酚的含量，结果竹沥中总酚质量分数为0.045%。熊艳等[11]采用HPLC对鲜竹沥口服液中愈创木酚的含量进行测定，该方法简单可靠，重复性好。陈碧莲等[12]采用高效毛细管气相色谱法对鲜竹沥中愈创木酚的含量进行测定，该方法简便，重复性好，灵敏度高。高吾名[13]采用原子吸收分光光度计和氨基酸分析仪对5个不同产地相同时令出厂的竹沥油中6种无机元素和氨基酸进行分析，结果竹沥油中6种无机元素和氨基酸含量因产地不同差异较大，但每种无机元素占6种元素总量的比例和各种氨基酸的分布比例却有一定的规律。笔者在对鲜竹沥生产加工企业调研中发现，不少企业使用水煮、高温蒸等方法代替标准规定的干馏法加工鲜竹沥，甚至有的生产企业直接使用蔗糖进行勾兑，严重影响鲜竹沥及制剂质量，而鲜竹沥收载于1992年版《卫生部药品标准中药材》(第1册)，该标准项下有以酪氨酸为对照的薄层色谱鉴别、pH、相对密度以及总固体质控项目，无指标成分含量测定项[2]，难以有效控制其质量。加之鲜竹沥制备工艺特殊，影响干馏工艺因素较多。因此，非常有必要对鲜竹沥现行标准进行提高，保障产品的质量，规范市场秩序。本课题组对鲜竹沥化学成分进行系统分析，其中单糖和双糖为鲜竹沥中的主要特征成分，目前尚未见测定鲜竹沥中单糖和双糖的文献报道。

本实验收集了按标准干馏法制备的9批鲜竹沥和按古法直火烤的方法制备的样品以及采用高温蒸、水煮方法制备的非标准方法样品，采用高效液相色谱-蒸发光散射检测器法同时测定上述样品中单糖和双糖的含量，以此考察不同加工方法制备的鲜竹沥中单糖和双糖含量差异，经方法学考察，该方法专属性强，准确可行，重复性好，可作为鲜竹沥的质量控制方法。

1 材料

1.1 仪器

LC 20AT高效液相色谱仪(日本岛津公司)；Alltech3300蒸发光散射检测器(美国奥泰公司)；Sartorius BT 25S型十万分之一电子天平(北京赛多利斯天平有限公司)。

1.2 试药

D-果糖对照品(批号：100231-201305，纯度：99.4%)、D-无水葡萄糖对照品(批号：110833-201205，纯度：99.5%)、蔗糖对照品(批号：111507-201303，纯度：99.8%)均购自中国食品药品检定研究院；乙腈为色谱纯；水为娃哈哈饮用纯净水；其他试剂均为分析纯。

鲜竹沥来源：样品1～9为铜鼓县伟升实业有限公司生产；样品10～13为青春康源制药有限公司生产；样品14为红枫鲜竹沥厂生产；蒸(高温)、煮、直火烤为自制样品。

2 方法与结果

2.1 对照品溶液的制备

精密称取D-果糖、D-无水葡萄糖、蔗糖对照品适量，加水分别制成含D-果糖162.710 46 μg·mL-1、D-无水葡萄糖211.388 4 μg·mL-1、蔗糖218.761 6 μg·mL-1的对照品溶液。

2.2 供试品溶液的制备

取鲜竹沥样品2 mL，置50 mL量瓶中，加水稀释至刻度，摇匀，即得。

2.3 色谱条件

Luna®Omega SUGAR 100Å色谱柱(250 mm×4.6 mm，3 μm)；流动相为乙腈-水(85∶15)；流速为1.0 mL·min-1；柱温为35 ℃，ELSD漂移管温度为70 ℃；N2流速为2.0 L·min-1。见图1。

注：A.混合对照品；B.鲜竹沥样品；1.果糖；2.葡萄糖；3.蔗糖。图1 混合对照品和鲜竹沥样品HPLC-ELSD图

2.4 线性关系考察

取2.1项下的混合对照品溶液5、10、15、20、25 μL，按2.1色谱条件进样分析，以对照品进样量的对数为横坐标，以峰面积积分值的对数为纵坐标，绘制标准曲线，结果见表1，表明各糖类成分的线性关系良好。

表1 线性关系考察结果

2.5 检测限与定量限

取已知浓度的混合对照品溶液，逐级稀释，按2.1色谱条件测定。信噪比为3∶1时，测得果糖、葡萄糖、蔗糖检测限分别为0.10、0.30、0.15 mg·mL-1；信噪比为10∶1时，测得果糖、葡萄糖、蔗糖定量限分别为0.73、1.36、1.31 mg·mL-1。

2.6 精密度试验

精密吸取按2.2项下方法制备的供试品溶液10 μL，在2.1色谱条件下连续进样6次，测定峰面积，结果果糖、葡萄糖、蔗糖峰面积平均值分别为379 461、299 135、398 264，RSD分别为1.3%、1.7%和1.6%，表明方法精密度良好。

2.7 重复性试验

精密称取同一批号(批号：20180822)的鲜竹沥样品6份，分别按2.2项下方法制备供试品溶液，在2.1色谱条件下进行分析测定，果糖、葡萄糖、蔗糖平均质量浓度分别为5.403 6、6.391 2、6.236 6 mg·mL-1，RSD分别为1.3%、0.9%和1.7%，表明试验重复性良好。

2.8 稳定性试验

精密吸取同一供试品溶液(批号：20180822)10 μL，分别于0、6、12、18、24 h进样测定，结果果糖、葡萄糖、蔗糖峰面积平均值分别为369 903、290 412、376 556，RSD分别为1.2%、1.8%和1.6%，说明供试品溶液在24 h内稳定。

2.9 加样回收率试验

取上述已测含量的鲜竹沥样品(批号：20180822) 1 mL，共6份，精密称定，分别精密加入D-果糖、D-无水葡萄糖、蔗糖对照品适量，分别按2.2项下方法制备供试品溶液，精密吸取10 μL注入高效液相色谱仪，记录色谱图，计算平均加样回收率，果糖、葡萄糖、蔗糖的平均回收率分别为98.1%、97.5%、99.2%，RSD分别为1.3%、0.9%、1.1%，表明方法准确度符合要求。结果见表2。

表2 鲜竹沥3个成分的加样回收率试验结果(n=6)

2.10 样品测定

按拟订的含量测定方法，测定17批鲜竹沥样品中3种糖类成分的含量，结果见表3。

表3 样品的含量测定结果 mg·mL-1

3 结果与讨论

选用了Prevail Carbohyrate ES(250 mm×4.6 mm，5 μm)、Agilent ZORBAX NH2(250 mm×4.6 mm，5 μm)和Luna®Omega SUGAR 100Å(250 mm×4.6 mm，3 μm)3根色谱柱，本次实验Luna®Omega SUGAR 100Å(250 mm×4.6 mm，3 μm)色谱柱的分离效果最好。

比较了流动相乙腈-水(75∶25)、乙腈-水(80∶20)、乙腈-水(85∶15)、甲醇-水(75∶25)、甲醇-水(80∶20)、甲醇-水(85∶15)，结果以乙腈-水(85∶15)作为流动相效果最好。

铜鼓县伟升实业有限公司采用的标准干馏法与古法直火烤工艺一致。铜鼓县伟升实业有限公司生产的9批样品中糖总量为18.0～21.9 mg·mL-1，平均含量为20.1 mg·mL-1，与自制直火烤样品中糖总量差异不大，且均检出3种糖类成分。

青春康源制药有限公司可能人为添加蔗糖。青春康源制药有限公司生产的4批样品中3批未检出葡萄糖，且蔗糖含量异常高。

自制样品中蒸(高温)工艺制备的样品3种糖类成分均未检出，水煮工艺制备的样品只检出蔗糖，直火烤工艺制备的样品均检出果糖、葡萄糖、蔗糖。

4 结论

通过建立鲜竹沥中单糖和双糖的含量测定方法，可以对生产工艺蒸(高温)、水煮以及人为添加进行区分，具有专属性。