知母种苗质量分级标准研究△

陈彩霞，马春英，李先恩，付静，张志强，赵晨光，侯俊玲，王文全，

1.中国医学科学院 北京协和医学院 药用植物研究所，北京 100193；2.河北农业大学 农学院，河北 保定 071000；3.北京康仁堂药业有限公司，北京 101301；4.北京中医药大学 中药学院，北京 102488；5.中药材规范化生产教育部工程研究中心，北京 102488

知母AnemarrhenaasphodeloidesBge.为百合科多年生草本植物，以干燥根茎入药，为我国常用大宗中药材，历版《中华人民共和国药典》(以下简称《中国药典》)均有收录，具有清热泻火、滋阴润燥的功效[1]。知母主要化学成分为皂苷类和双苯吡酮类化合物。现代药理研究表明，知母具有抗血小板血栓、改善阿尔茨海默症、抗肿瘤、抗炎、解热等作用[2]。其中知母皂苷AⅢ和BⅡ在抗老年痴呆方面有较好的疗效，且知母皂苷AⅢ 通过诱导细胞凋亡的途径可成为较好的抗癌药物或先导化合物[3-4]，因此具有较高的研究价值和良好的开发前景。

知母药材生产通常采用育苗1年，移栽1～2年的栽培方式，种苗质量与植株生长发育、药材产量及品质密切相关[5]。于福来等[6]以种球直径和侧根数为质量指标制定了知母种苗质量分级标准，田间试验证明不同等级种苗产出的药材在化学成分含量上存在差异；马春英等[7]利用种苗的单株质量、须根数和种球直径确定了西陵知母的种苗质量等级标准。产地调研发现，知母种苗移栽易成活，从春季土壤解冻到雨季7—8月均可移栽种植。一般具有灌溉条件的基地，多集中在春季4中旬左右种植。没有灌溉条件的山地，多选择在6月初进入雨季后及时种植。不同种植时期、不同批次的知母种苗质量可能存在差异。已有关于知母种苗的质量标准多以春季种植的种苗为主，不能涵盖整个种植时期的种苗质量。为规范知母种苗流通标准，使知母种苗质量分级标准更科学、简单易行且对生产有指导意义，本研究通过调查春季、雨季知母种植基地及市场销售种苗的质量相关指标，参考种植生产以及市场流通种苗的选择标准，确定种球直径和百株质量为知母种苗的质量分级指标，并通过K-均值聚类分析对收集种苗进行初步等级划分，以各等级种苗为试验材料进行田间对比种植，连续2年追踪调查移栽后植株生长动态、药材产量及品质状况，验证知母种苗质量标准的合理性与可行性，以期为知母药材的规范化生产提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 材料

知母种苗材料收集主要根据种植生产和市场交易相对集中的春季和雨季分2个时期进行。 2017年4月上旬收集安国种苗基地及市场销售的1年生知母种苗共1004株，6月上旬收集市场销售的种苗3200株，作为研究材料，经中国医学科学院药用植物研究所王文全研究员鉴定，为百合科植物知母A.asphodeloidesBge.的种苗。

1.2 方法

1.2.1 种苗基地田间收集与调查方法 4月初选择知母主产区的种苗基地，设置4个大小为2 m×2 m的样方，每个样方随机抽取50株种苗，共计200株，分别对其株高(cm)、地茎(芦头上部接近地面处的直径cm)、种球直径(mm)、侧根数(个)、单株质量(g)进行测定。

1.2.2 药材市场销售种苗质量调查 4月上旬按照药材市场的种苗销售标准，分别收集不同等级种苗，其中Ⅰ级苗10 kg、Ⅱ级苗5 kg、Ⅲ级苗2.0 kg、Ⅳ级苗1.0 kg，保证每类种苗200株左右，共收集种苗804株。分别对其株高、种球直径、地茎、侧根数、单株质量等质量指标进行检测。6月上旬分别收集Ⅰ级、Ⅱ级、Ⅲ级、Ⅳ级不同等级种苗各800株，共计3200株，主要根据市场交易标准进行了百株质量、单株质量测定以及实际种植时的单株质量。

种苗质量指标确定及初步等级划分 依据收集的知母种苗质量指标测定数据，利用相关性分析、主成分分析，并结合种苗市场流通和生产实际标准，确定知母种苗的质量分级指标，通过K-均值聚类分析，对知母种苗进行质量等级的初步划分。

1.2.3 不同等级种苗田间对比栽培试验 将不同等级种苗种植于河北安国种苗基地，试验采用随机区组设计，每小区6 m2，3次重复，移栽株行距为20 cm×25 cm，小区间设置50 cm空地作为隔离行。移栽后浇透水，进行常规田间管理，未施用任何肥料。

1.2.4 不同等级种苗产量和药用成分含量测定 连续2年于秋季进行知母植株保存率和药材产量相关指标的调查测定。每小区随机选取30样株，3次重复。对种植2年收获的药材清洗干净后55 ℃烘箱干燥后粉碎，根据《中国药典》进行有效成分含量检测。所有数据经SPSS 20.0 统计软件分析。

2 结果与分析

2.1 知母种苗质量指标调查

根据知母种苗质量特点，并结合生产实践，对影响知母种苗质量的株高(叶长)、侧根数、单株质量、地茎和种球直径5个质量指标进行了测定，统计分析见图1～5。

图1 知母种苗株高的频率分布

图2 知母种苗侧根数的频率分布

图3 知母种苗单株质量的频率分布

图4 知母种苗地茎的频率分布

图5 知母种苗种球直径的频率分布

由图1～5看出，知母种苗质量指标株高、侧根数、地茎及种球直径都遵循正态分布。单株质量的频数分布中0～20 g的植株所占比例较高，这可能与市售知母种苗主要以质量为交易指标有关。实地调研知母种苗市场销售现状发现，相同质量条件下，种苗越小，种苗数量越多，为降低生产成本，药农更倾向于购买植株个体小的种苗，因此导致市场销售种苗普遍偏小，而市场收集种苗在本次调查种苗中所占比例较高(约为80%)，进而使所有调查种苗单株质量的频数分布有所偏差。所有知母种苗质量指标的调查结果描述统计量见表1。

表1 知母种苗质量指标描述统计量(n=1004)

注：因知母为基生叶，株高指叶片长。

表1数据显示，知母种苗单株质量的变异系数最大，为0.878 9，其次是侧根数、地茎和种球直径，株高的变异系数最小。不难看出，单株质量、侧根数、种球直径及地茎对知母种苗质量的影响更大。在评定种苗质量时，测定指标越多，所得种苗质量信息越完整，但在实际生产中，很难对每株苗的多个指标都进行检测。由于各指标间具有一定相关性，多个质量指标的信息往往是重叠的[8]。为保证质量标准的制定即具科学性，又便于生产中操作，在制定知母种苗质量标准时，必须选择既能反映种苗质量，又方便测量，且在种苗生产、交易过程中具有实际应用价值的因子作为知母种苗的质量分级指标。

为明确知母种苗各质量指标之间的相关性，对知母种苗的5项检测指标进行相关性分析，结果见表2。

表2 知母种苗5项质量指标的相关性分析

注：*P<0.05；**P<0.01。

表2数据表明，种球直径与其他各项质量指标均呈极显著正相关关系(P<0.01)，其中与地茎间相关系数最高，为0.880，与单株质量、侧根数及株高的相关系数分别为0.745、0.589和0.145。单株质量与地茎、侧根数和株高也呈显著正相关，相关系数分别为0.718，0.672和0.351。相关分析结果表明，知母种苗各检测指标之间存在重叠，可通过主成分分析法，结合生产实践确定知母种苗的主要分级指标。

2.2 知母种苗质量指标的确定

为确定影响知母种苗质量的主导因子，对种球直径、单株质量、侧根数、地茎、株高5个指标进行了主成分分析，结果见表3。

表3 主成分特征值、贡献率及累计贡献率

主成分分析第一个特征向量为：

F=0.505X1+0.745X2+0.857X3+0.894X4+0.923X5

(1)

式中：X1代表株高，X2代表侧根数，X3代表单株质量，X4代表地茎，X5代表种球直径。

表3结果表明，主成分1、2、3的贡献率分别为63.92%、17.708%、9.822%，累计贡献率已达到91.452%，说明前3个主成分基本包含了知母种苗全部的指标信息，可以很好的表达知母种苗的质量。第一主成分中载荷最大的为种球直径，其次是地茎>单株质量>侧根数>株高。前期研究中，于福来等[6]以种球直径和侧根数为质量指标确定了知母种苗的分级标准。马春英等[7]通过研究确定了西陵知母种苗的质量分级指标为侧根数、单株质量和种球直径。生产上种球直径是反映根鲜重和种苗质量的重要指标。相关性分析结果表明，种球直径和地茎、侧根数、单株质量均呈极显著正相关，为避免指标重叠，简化检测指标，种球直径可考虑作为知母种苗质量的决定性指标。种苗重量与种苗大小、健壮程度密切相关，是知母种苗市场流通中的重要指标，且常以百株质量作为评估指标。为保证知母种苗质量标准，既能科学反映种苗的基本性状，又方便种苗交易且具有广泛的商业应用价值，因此本研究拟采用种球直径和百株质量作为知母种苗质量的分级指标，其中种球直径为衡量知母种苗重量的决定性指标，百株质量作为知母种苗质量评价的参考指标。

2.3 知母种苗质量初步分级

2.3.1 知母种苗质量指标K-均值聚类分析 知母种苗质量等级类型的划分采用K-均值聚类分析法，按类间距距离大小依次对各指标进行质量等级分类，单项因素分别K-均值聚类分析的最终类中心值见表4。以种球直径和百株质量(单株质量×100)2个指标将知母种苗聚为3类(见表4)。

表4 知母种苗质量分级指标最终聚类中心值

2.3.2 市场销售知母种苗等级划分标准分析 市场实地调研发现，不同时期市场销售的知母种苗均按照种苗质量不同进行分类销售。知母为根状茎，叶由基部丛生，呈细长披针形，因此知母种苗地上部分实际为知母的叶片。生产中使用的知母种苗，均为前一年春季播种的种苗。根据知母的生物学特性，自春季萌发开始生长直至6月中旬，知母多通过消耗自身根系贮存的营养用于地上部分生长，因此随着种植时期延后，知母种苗芦头直径变化不大，主要表现在植株地上部分叶片的快速增长，进而导致种苗鲜质量的迅速增加。为此，对6月初收集的来自市场销售的不同等级种苗，主要进行了种苗质量指标测定，结果见表5，以期为知母种苗质量分级标准的制定提供参考依据。

表5 市售知母种苗不同等级质量分布情况

随着种植时期延后，地面温度升高，知母种苗叶片面积过大容易造成植株失水萎蔫难以成活。实际种植过程中为保证成活率，减少叶片水分蒸发，种植户多以地上部叶片长度不超过10 cm的标准进行种植。种植较早地上部分叶片不超过10 cm的可以不用修剪地上叶片。可见，不同种植时期市售知母种苗质量差异较大，但实际种植时的种苗标准相近，这为制定知母种苗质量标准提供了参考依据。表5中种植时种苗平均单株质量是根据实际种植需要，减去部分地上部叶片时单株质量的平均值。从数据看出，市售不同等级知母种苗种植时的百株质量分别为Ⅰ级3.975 kg、Ⅱ级2.1 kg、Ⅲ级0.8 kg、Ⅳ级0.362 5 kg。按照每亩(1亩≈666.7 m2，下同)移栽8800株苗计算，Ⅰ级苗的使用量为176 kg，Ⅱ级苗使用量为132 kg，Ⅲ级苗使用量为88 kg，过于大的种苗因单位质量种苗株数少导致生产成本过高，过小的Ⅳ级苗又会影响药材产量，因此Ⅰ级种苗交易量很小，比较受欢迎的是Ⅱ级、Ⅲ级种苗，交易量最大。为了符合药材种植户的生产需求，降低生产成本，同时又能保证知母种苗质量，在知母种苗标准制定时需对种苗的百株质量进行一定限制。

2.3.3 知母种苗质量标准的初步划分 种球直径是衡量知母种苗质量的决定性指标，根据知母种苗质量分级指标的最终聚类中心值，为便于生产应用，将其尾数采用四舍五入的方式进行修订，得到各等级分类值为Ⅰ级1.2 cm，Ⅱ级0.8 cm，Ⅲ级0.5 cm。百株质量根据最终聚类中心值，Ⅰ级1.989 kg，Ⅱ级1.436 kg，Ⅲ级0.957 kg，将各指标尾数采用0或5进位取整法进行修约，同时参考市场销售不同等级种苗实际种植时的百株质量值，对Ⅲ级种苗的最小值进行了限制，基本包括了知母实际种植生产中种苗等级Ⅱ级2.0 kg和Ⅲ级0.8 kg种苗，但为避免种苗过小影响药材产量，对知母种苗百株质量进行了限制。因此，知母种苗质量等级初步划分标准见表6。

表6 知母种苗质量等级初步划分标准

注：百株质量是指种植时经过适当剪叶处理(保留叶片长度不超过10 cm)100株种苗的质量。

2.4 知母种苗分级种植对知母植株生长、药材产量和质量的影响

对移栽种植1、2年后各等级种苗的存活率、种球直径、单株根质量等指标进行测定，结果见表7～8。对种植2年收获的药材烘干后粉碎，根据《中国药典》方法对知母皂苷和芒果苷含量进行测定，结果见表9。

表7 不同等级种苗种植1年植株的生长状况

注：表中同列不同小写字母表示P<0.05(LSD检验)，下同。

表7数据结果表明，不同等级知母种苗种植1年后，植株存活率、种球直径以及单株根质量均有所不同。Ⅰ级、Ⅱ级种苗种植后经过一个生长季植株的存活率没有显著差异，但均显著大于Ⅲ级种苗的存活率；Ⅰ级种苗种植后的种球直径显著大于Ⅱ级、Ⅲ级，单株根质量则是Ⅰ级种苗显著大于Ⅱ级，Ⅱ级种苗显著大于Ⅲ级。种球直径是反映知母种苗根鲜质量和种苗质量的重要指标，种苗的质量又与种苗大小、健壮程度密切相关，因此不同等级种苗导致种苗大小和健壮程度显著不同，进而影响了植株的成活率和生长势。

表8 不同等级种苗种植2年植株生长性状表现

由表8可见，不同等级知母种苗种植2个生长季后，植株的存活率相对稳定，种植初期的种苗等级划分决定了种植2年后保存的株数不同进而导致药材产量显著不同，但同一等级种苗种植2年与种植1年的存活率差异无统计学意义。不同等级种苗在种植2个生长季后种球直径差异无统计学意义，说明在一定生长空间内，知母植株的生长会有更多的营养用于与药材产量密切相关的根茎生长，进而表现在单株根鲜质量的显著不同。单株根鲜质量表现在Ⅰ级种苗要优于Ⅱ级、Ⅲ级的种苗，这与Ⅰ级种苗健壮、恢复生长快、生长势强有关。不同等级知母种苗种植2年后收获药材鲜质量表现为Ⅰ级>Ⅱ级>Ⅲ级，知母种苗等级划分对知母药材生产中稳定产量具有重要意义。

对不同等级种苗种植2年后收获的药材进行品质评价，结果见表9。不同等级知母种苗种植2年后，收获的药材均能达到《中国药典》的质量标准，即水分≤12.0%，总灰分≤9.0%，酸不溶性灰分≤4.0%，芒果苷质量分数≥0.7%，知母皂苷BⅡ质量分数≥3.0%。但不同等级种苗种植后，对药材质量的影响差异无统计学意义。这与于福来的研究结果，即不同等级种苗种植后收获的药材药用成分含量间存在统计学意义上的差异有所不同。分析原因，可能与种植材料、栽培管理或种植环境不同所致，有待进一步的实验验证。

总之，本研究采用生产上常用的1年育苗2年移栽的栽培方式，研究不同等级种苗对比种植后对知母药材产量和质量的影响，结果表明种苗质量分级对药材产量有显著影响，但对药材质量的影响差异无统计学意义。

2.5 种苗分级与植株生长、药材产量及质量的相关性分析

为进一步明确种苗分级对药材产量及质量的影响机制，对种苗等级与植株生长性状、药材产量及质量指标的相关性进行分析，结果见表10。

知母种苗等级与植株存活率、种球直径、单株根质量、小区产量及芒果苷含量均呈负相关，但只有单株根质量和小区产量与种苗等级的相关性达到显著水平，说明种苗等级划分主要通过单株根质量来影响药材产量。种苗等级与活性成分芒果苷含量与知母皂苷BⅡ的含量均没达到显著相关。

3 结论与讨论

优质种苗是提高中药材产量和质量的保证，进行知母种苗质量分级可为规范知母种苗市场，提高种苗质量和促进中药材知母的规范化栽培生产提供参考依据[9-11]。为保护知母种苗生产、经营和使用者的利益，建立更符合生产实际的知母种苗质量标准，本研究通过对春季和雨季2个时期知母种苗基地与市场销售种苗的质量指标进行检测，利用SPSS 20.0软件通过相关分析和主成分分析，并结合生产实际，确定了种球直径和百株质量为知母种苗的质量分级指标。利用K-均值聚类分析确定了知母种苗等级划分的中心值，结合市场流通知母种苗的交易标准，及基地种植过程中知母种苗的使用情况，确定了知母种苗质量等级的划分标准，其中Ⅰ级种苗：种球直径≥1.2 cm，百株质量≤2.0 kg；Ⅱ级种苗：种球直径≥0.8 cm，百株质量≤1.5 kg；Ⅲ级种苗：种球直径≥0.5 cm，百株质量≤1.0 kg且≥0.5 kg，且不同等级种苗田间种植试验验证了知母种苗质量等级划分标准的可行性。种苗等级与植株生长性状、药材产量和质量的相关性分析表明，种苗等级可通过影响植株存活率和单株根鲜质量来影响药材的产量。由于植株生长、药材产量和品质受诸多因素影响，如种苗产地、生态环境及栽培措施等，本试验是在相同栽培管理条件下，研究了种苗分级对植株生长性状、药材产量和品质的影响，没有涉及产地环境与栽培措施对植株生长、药材产量和品质的影响，环境及栽培措施能否弥补较低等级种苗质量差带来的不足还有待进一步研究。

表9 不同等级种苗种植对收获药材质量的影响 %

表10 种苗等级与植株生长性状、药材产量和质量的相关性分析

注：*P<0.05。

药材种植后能否获得优质高产很大程度上取决于种苗的优劣[12-15]。本标准与以往知母种苗质量标准研究结果的不同之处，在于充分考虑了不同时期种苗质量差异，以及市场销售和种植生产中采用的标准，并利用各质量指标之间的显著相关性，简化种苗标准的质量指标，选择种球直径作为知母种苗质量的决定性指标，并首次结合知母种苗市场流通和种植生产实际，引入了百株质量作为主要参考指标，既保证了知母种苗质量标准的科学性，又有可操作性，也更符合生产实际，对于知母药材的规范化栽培生产具有现实可行的指导意义。