外周血T淋巴细胞亚群及早期炎症标志物表达对老年非小细胞肺癌化疗预后的影响分析

肺癌（lung cancer，LC）是临床上常见的恶性肿瘤之一，主要包括小细胞肺癌（small cell lung cancer，SCLC）和非小细胞肺癌（non-small celllungcancer，NSCLC），其中NSCLC 约占总数的85﹪以上。临床上针对LC的治疗仍以手术切除为主，但是由于部分患者缺乏早期诊断，发现时已失去手术机会，同步放化疗成为治疗LC的主要方式[1]。相关研究表明，NSCLC的发生发展与机体免疫功能紊乱密切相关，其中与T淋巴细胞亚群和炎症标志物的紊乱最为密切[2-3]。因此，有学者提出将CD3+、CD4+等T细胞亚群、中性粒细胞与淋巴细胞比值（neutrophils to lymphocytes ratio，NLR）、血小板与淋巴细胞比值（platelet to lymphocyte ratio，PLR）及淋巴细胞与单核细胞比值（lymphocyte to monocyte ratio，LMR）的检测作为反映NSCLC患者手术预后的指标，但是针对放疗患者预后的评价尚缺乏相关数据支撑[4-5]。本文旨在探究外周血T细胞亚群和早期炎症标志物对老年NSCLC患者化疗后预后的影响，为探索NSCLC的治疗提供新的临床思路。

资料与方法

一、一般资料

1.入选基线资料：选取2015年1月至2018年12月在武汉科技大学附属孝感医院接受化疗的老年NSCLC患者86例，另选82名在本院常规体检的健康人群作为对照组，其年龄、性别与NSCLC组差异无统计学意义，具有可比性。86例NSCLC患者中，男56例，女30例；年龄55～74岁，平均（65.87±4.31）岁；TNM 分期：Ⅰ期10例，Ⅱ期8例，ⅢA期16例，ⅢB期8例，Ⅳ期44例。

纳入标准：（1）均经病理学检查证实为NSCLC，入组前未行抗肿瘤治疗；（2）均无明显的感染征象，入组前未行抗炎治疗；（3）在本院行化疗治疗，并在化疗后7 d 采集空腹静脉血，通过检验科对各类细胞进行计数；（4）均具有完整病例资料且可完成随访；（5）无机体其他部位肿瘤病史；（6）无严重心、肝、肾等重要脏器功能不全；（7）本研究经医院伦理委员会批准（编号：XG20190028）。

排除标准：（1）存在化疗禁忌症或对化疗药物过敏的患者；（2）3个月内有感染性疾病病史的患者；（3）伴有血液系统疾病的患者；（4）伴有心、肝、肾等脏器功能不全的患者。

2.主要的试剂及器材：EDTA-K2 型抗凝采血管（邦标医疗科技有限公司），CD4/FITC、CD8/PE双标抗体、红细胞裂解液、PBS 缓冲液、流式细胞仪EPIC-XL 型流式细胞仪（美国贝克曼库尔特公司）。

二、方法

1.外周血T淋巴细胞亚群检测：用EDTA-K2型抗凝血采血管采集患者及对照组清晨空腹静脉血5～8 ml，室温下放置，取100 μl 静脉血置于3个流式管内，并标记为1、2、3 号，将20 μl 同型对照加入1 号管内，然后将CD4/FITC 及CD8/PE 双标抗体20 μl 分别加入2 号及3 号管内，3 支管在室温下避光孵育20 min，再加入红细胞裂解液各500 μl，避光孵育15 min，将PBS 缓冲液加入管中清洗3遍后用离心机5000 ×g离心5 min，再次加入PBS 缓冲液500 μl 进行重悬，最后用流式细胞仪检测各T淋巴细胞亚群比例。

2.早期炎症标志物检测：采集NSCLC 组及对照组清晨空腹静脉血5 ml，用全自动血液分析仪检测外周血中性粒细胞绝对值、淋巴细胞绝对值、单核细胞绝对值、淋巴细胞比率及血小板水平。

3.化疗方案：根据NCCN 指南制定化疗方案，包括紫杉醇＋铂类、吉他西滨＋铂类、长春瑞滨＋铂类、培美曲塞＋铂类等。

4.观察指标：观察指标包括外周血T淋巴细胞亚群及早期炎症标志物水平。将中性粒细胞计数（neutrophil，NEUT）、淋巴细胞计数（lymphocyte count，LY）、单核细胞计数（monocytes，MONO）、淋巴细胞百分率（lymphocyte percentage，LY﹪）、NLR、PLR 及LMR 作为反映机体炎症水平的标志物。根据参考文献报道：以CD3+T 均值68.4﹪为临界值，CD4+T 均值36.6﹪为临界值，CD8+T 均值31.8﹪为临界值，CD4/CD8 均值1.28位临界值，NLR 均值3.16为临界值，PLR 均值197为临界值，LMR 均值3.6为临界值[6-7]。

表1 两组患者外周血T淋巴细胞亚群分布差异（±s）

表1 两组患者外周血T淋巴细胞亚群分布差异（±s）

注：NEUT为中性粒细胞计数；LY为淋巴细胞计数；MONO为单核细胞计数；PLT为血小板计数

分组例数 CD3+ CD4+ CD8+ CD4+/CD8+ NEUT（×109/L）LY（×109/L）MONO（×109/L）PLT（×109/L）LY﹪对照组 82 71.31±6.02 40.20±5.79 28.43±6.37 1.49±0.37 4.20±1.35 1.67±0.61 0.51±0.23 211.32±54.18 25.65±6.87 NSCLC 组 86 68.22±7.09 36.61±7.11 31.79±9.88 1.30±0.56 4.01±1.28 2.03±0.88 0.52±0.22 229.73±58.84 30.01±8.45 t 值 3.038 3.579 2.606 2.582 0.936 3.068 0.288 2.107 3.659 P 值 0.003＜0.001 0.010 0.011 0.350 0.003 0.774 0.037＜0.001

三、统计学分析方法

采用SPSS22.0 软件进行统计学分析，外周血T淋巴细胞亚群与炎症细胞水平数据用表示，两组间比较采用独立样本t检验，例数用﹪表示。采用Kaplan-Meier法进行单因素生存分析，Cox比例回归风险模型进行多因素生存分析。以P＜0.05为差异具有统计学意义。

结 果

一、NSCLC 组与对照组患者外周血T淋巴细胞亚群与炎症细胞分布差异比较

与对照组比较，NSCLC 组CD3+、CD4+、CD4+/CD8+均较低，而CD8+、PLT、LY 及LY（﹪）均较高，差异具有统计学意义（P均＜0.05）；两组NEUT、MONO 水平相比，差异无统计学意义（P＞0.05，表1）

二、不同临床参数患者Kaplan-Meier 单因素生存分析

采用Kaplan-Meier法进行单因素生存分析结果显示，不同性别、年龄、吸烟史及病理类型的患者生存期相比，差异无统计学意义（P＞0.05），而是否淋巴转移、远处转移及不同TNM 分期的患者生存期相比，差异具有统计学意义（P＜0.05，表2，图1）

表2 不同临床参数患者Kaplan-Meier 单因素生存分析

图1 不同临床参数患者生存曲线比较

三、化疗后不同T细胞亚群和炎症细胞水平的患者Kaplan-Meier 单因素生存分析

采用Kaplan-Meier 单因素生存分析结果显示，化疗后，CD8+T细胞≥31.8﹪、CD4/CD8＜1.28、NLR＜3.16 及PLR＜197的患者生存期较长，差异均有统计学意义（P＜0.05），而不同CD3+T、CD4+T细胞、LMR 数值的患者生存期相比，差异无统计学意义（P＞0.05，表3，图2）

四、NSCLC患者Cox多因素生存分析

利用Cox比例回归风险模型对Kaplan-Meier单因素生存分析结果进行多因素分析，结果显示，伴远处转移、TNM 分期ⅢB-Ⅳ期、CD8+T细胞＜31.8﹪、NLR≥3.16 及PLR≥197是影响NSCLC患者预后的独立影响因素（P＜0.05，表4）。

表3 化疗后不同T细胞亚群和炎症细胞水平的患者Kaplan-Meier 单因素生存分析

图2 化疗后不同T细胞亚群和炎症细胞水平的患者生存曲线比较

表4 非小细胞肺癌患者Cox多因素生存分析

讨 论

随着对免疫机制研究的不断深入，学者发现全身炎症状态及免疫功能紊乱在LC的发生发展中起重要作用。外周血T淋巴细胞亚群及早期炎症细胞已被广泛应用于监测恶性肿瘤的发展及评估患者预后[8-9]。CD3+可代表机体总T淋巴细胞，可反映机体细胞免疫的整体情况。CD4+T细胞是一种辅助性T淋巴细胞，能够分泌白介素-2、白介素-4、干扰素-γ等免疫抑制性因子，从而起抑制肿瘤生长及转移的作用[10]。CD8+T细胞受到主要组织相容性复合体-1类分子的限制，能够分化为细胞毒性T细胞、肿瘤直接杀伤细胞等。另外，相关研究发现，多种血液指标如白细胞、中性粒细胞、淋巴细胞及单核细胞等都参与了机体肿瘤的全身炎性反应，但是由于单一的免疫细胞数量稳定性差，学者提出以NLR、PLR 以及LMR 作为预测癌症治疗的预后，并取得了较好的效果[11-13]。

本研究结果显示，NSCLC 组患者CD3+、CD4+、CD4+/CD8+低于对照组（P＜0.05），CD8+、PLT、LY及LY（﹪）高于对照组，差异具有统计学意义（P＜0.05），与熊佳时等[14]报道一致，表明NSCLS 患者相比健康人群存在较为明显的免疫功能低下。另外，将入组患者的临床数据利用Kaplan-Meier法行单因素生存分析，结果显示，有无淋巴转移、远处转移、不同TNM 分期、CD8+T细胞≥31.8﹪、CD4/CD8＜1.28、NLR＜3.16 及PLR＜197的患者生存期相比差异具有统计学意义（P＜0.05）。表明无淋巴结转移及远处转移、TNM 分期、CD8+T细胞、CD4/CD8、NLR、PLR 水平是影响患者化疗后预后的主要因素，而之前的报道关于TNM 分期对患者化疗后预后的影响也得到了类似的结果[15]。相关研究显示，NSCLC患者CD4/CD8 水平是影响其预后的独立因素，比值越低，预后越差，与本文CD4/CD8＜1.28的患者生存期较长的结果不符，分析原因可能是CD4/CD8 比值降低是CD4+T细胞比例降低及CD8+T细胞比例升高的共同结果，而CD8+T细胞高表达的患者往往可获得更长的生存期[16-18]。CD8+T细胞并非单一细胞群，根据细胞表面CD28的表达可分为CD8+CD28-T细胞（抑制性T细胞，Ts）及CD8+CD28+T细胞（细胞毒T细胞，CTL），前者具有抑制CTL 活性和T淋巴细胞增殖的作用。CTL细胞是机体获得性免疫的效应细胞之一，在肿瘤免疫的过程中发挥重要作用[19]。通过Spearman 分析显示，NSCLC患者预后水平与TNM 分期、NLR 及PLR 水平呈负相关，而CD8+T细胞水平与患者预后呈正相关。临床研究表明，NLR、PLR 可作为独立预测肿瘤患者生存期的指标，尤其是行手术治疗的患者，NLR、PLR 可独立预测术后复发和死亡的风险，本文研究结果也证实，NLR＜3.16 及PLR＜197的患者可获得更长的生存期，与临床相关报道相符[20]。

综上所述，外周血CD8+T细胞、CD4/CD8 比值、NLR 及PLR 水平是影响老年NSCLC 预后的独立影响因素，可作为评估老年NSCLC患者化疗预后的简易生物标志物。