19份马铃薯品种的SSR分析

高 慧， 王鹏伟， 刘 杰， 李 强， 于 卓， 于肖夏， 刘宏芳， 马艳红

(1.内蒙古农业大学， 呼和浩特 010019； 2.内蒙古华颂农业科技有限公司， 内蒙古 赤峰 025150；3.四子王旗农牧和科技局， 内蒙古 乌兰察布 011800)

表1 19份供试马铃薯品种食用类型及育成单位

编号材料名称 食用类型 育成单位 1青薯9号家庭食用(蒸煮、鲜食)青海省农林科学院2冀张薯 14家庭食用河北省高寒作物研究所3冀张薯8号家庭食用(加工全粉)河北省高寒作物研究所4大白花(2191) 家庭食用(加工全粉0张家口市农业科学院5冀张薯5号家庭食用河北省高寒作物研究所6冀张薯12号家庭食用河北省高寒作物研究所7中薯22号家庭食用中国农业科学院蔬菜花卉研究所8中薯19号家庭食用中国农业科学院蔬菜花卉研究所9雪川13家庭食用(炒食、凉拌)雪川农业发展股份有限公司10华颂11家庭食用华颂种业股份有限公司11华颂7号家庭食用华颂种业股份有限公司12中薯10号家庭食用(炸片、全粉)中国农业科学院蔬菜花卉研究所13中薯18号家庭食用(可用于淀粉加工)中国农业科学院蔬菜花卉研究所14红玫瑰家庭食用(炒食、蒸煮、土豆泥、凉拌)希森马铃薯产业有限公司15希森8号家庭食用(鲜食,炒食、蒸煮、土豆泥、凉拌)希森马铃薯产业有限公司165p-40家庭食用(炒食、蒸煮、土豆泥、凉拌),全粉加工希森三和马铃薯有限公司17希森6号家庭食用(适合炸薯条和全粉加工)希森马铃薯产业有限公司18华颂34家庭食用华颂种业股份有限公司19华颂33家庭食用华颂种业股份有限公司

马铃薯(SolanumtuberosumL.)别名洋芋、山药蛋、土豆、番芋等[1]，在植物学分类上隶属茄科(Solanaceae)茄属(Solanum)，是一年生块茎型草本植物[2-3]。马铃薯可兼具粮、菜、饲、作物及工业原料；生育期短、适种区域广、单位面积产量高、可用于加工的用途多、辐射范围广、产品类型多，越来越受到各国重视，是世界第四大作物[4-5]，在全世界范围内约有156个野生种、8个栽培种[6]。中国是马铃薯总产值最多的国家，而内蒙古是中国马铃薯的最大产区[7]。随着我国马铃薯主粮化战略的进一步实施，马铃薯在农业生产中的地位更为突出[8]。但马铃薯育种中存在着野生种质资源尚未进行完整的研究分析、遗传基础较狭窄不能达到育种目标需求、种薯抗病能力弱、种质资源相对缺乏等问题[9]，需要育种工作者不断选育综合性状优良的杂交新品种。

遗传多样性分析是有效利用种质资源的重要信息来源，马铃薯种质资源遗传多样性评价主要分为形态学指标评价和分子水平评价[10]。目前，SSR(Simple Sequence Repeat)分子标记以其重复性好、多态性丰富和共显性的优点[11]，已广泛用于植物遗传图谱构建、基因定位、种质资源评价、分子标记辅助育种、品种真实性鉴定、遗传关系分析等方面[12]。近年来，Duan等[13]从138个SSR标记中选出20个SSR标记分析了217个我国育成的马铃薯品种的遗传多样性，共扩增到249个等位基因，多态性比率高达97.99%，其中11个引物能够很好的区分217个马铃薯品种。Wang等[14]用30个SSR标记分析了292个国内外马铃薯种质材料，获得了174个等位基因，并将材料聚为两大类。Marie-José Cté等[15]用SSR标记进行了84个加拿大园艺马铃薯的遗传多样性分析。吴立萍等[16]用SSR分子标记对54 份俄罗斯血缘的马铃薯品种，14对多态性好的SSR引物共扩增出 229个多态性条带，多态性条带百分率达 92.7%，54份品种分为 10 类，从分子水平上揭示了各供试品种间的亲缘关系。Sapinder Bali等[17]用23个多态性的SSR 标记构建了264个Russet 及其他育种材料的指纹图谱，获得了142个多态性位点，发现材料间存在遗传多样性。本试验利用SSR分子标记技术对国内育成的19份马铃薯品种进行遗传多样性研究，明确材料间的亲缘关系，并为下一步马铃薯杂交育种的亲本选择奠定理论基础。

1 材料与方法

1.1 供试材料

供试的19份马铃薯种质资源材料均来源于河北省张家口市康保县华颂农业科技公司，详见表1。试验于2018年在康保县种子管理站区域试验基地进行。5月中旬播种，采用随机区组排列，重复3次,田间管理按照常规大田管理模式进行。

1.1.1试验地概况

供试材料种植在河北省张家口市康保县张纪镇王洪礼农业基地，该基地位于河北省西北部的坝上地区，地处冀蒙结合部内蒙古高原的东南端，属阴山穹折带，俗称“坝上高原”，海拔1 449 m，地理坐标为东经114°30′，北纬41°20′，康保县属东亚大陆性季风气候中温带亚干旱区，夏季凉爽，冬季寒冷，年均气温大约1.1 ℃，无霜期约为112 d，日照时数3 000 h，年平均降水量为360～400 mm，无霜期90～130 d，实验地的土壤为栗钙土，肥力较好，pH值为7.8～8.3。

1.1.2试验设计及播种管理

19个材料采用田间随机区组排列设计种植，田间管理按照常规大田管理模式进行。采用单行双垄点播，并设置保护行，播种之前撒入腐熟的牛粪和羊粪，株距为18 cm，行距为100 cm，小区面积133.5 m2，重复3次。在幼苗长到0.13 m左右时进行中耕除草；在现蕾期培土1次，高度为0.2 m；播种时撒施深旋复合肥(0.25 t·hm-2)为主，基肥穴施腐殖酸型复合肥(0.88 t·hm-2)，在植株生长期间适时灌水，及时除草和防御病虫害等。根据土壌肥力状况施入大量元素水溶性肥(0.15 t·hm-2)。

1.2 研究方法

1.2.1供试材料DNA的提取与纯度检测

在苗期08：00—10：00时采集各供试材料幼嫩叶片，液氮速冻保存带回实验室，用TianGen公司生产的新型高效植物基因组DNA试剂盒(DP 305)，按照操作说明进行DNA的提取，用NanoDrop 2000 c及1.6%琼脂糖凝胶电泳分别检测各待测品种DNA的纯度。将各供试材料的DNA浓度稀释至约50 ng·μL-1，得到的DNA溶液于-20 ℃冰箱贮存备用。

1.2.2SSR引物

试验所用130对SSR引物来源于NCBI网站公布及文献资料中马铃薯已开发的SSR特异引物序列[18]由上海生物工程有限公司合成，用于19个马铃薯品种的SSR多态性引物筛选。

1.2.3SSR-PCR反应所需体系及扩增程序

以提取的19个马铃薯品种DNA为模板，参照于卓等[5，7]PCR反应体系及扩增程序进行，20μL的SSR聚合酶链式反应扩增体系包含：1.4μL dNTPs(0.225 mmol·L-1)，2.0μL的10×Buffer(1.5 mmol·L-1，含Mg2+)，SSR上、下游引物( 0.5μmol·L-1)各0.7μL，0.09μL的TaqDNA聚合酶(5 U·μL-1)，1.0μL模板DNA(50 ng·μL-1)，14.11μL的ddH2O，试验所用生化试剂均购自天根(北京)生物工程有限公司。SSR的聚合酶链式反应条件为:95 ℃预变性 60 s，94 ℃变性30 s，56 ℃退火45 s，72 ℃延伸90 s，35个循环，72 ℃ 延伸10 min，4 ℃低温保存。

预扩增产物变性：待扩增产物冷却降温后，每RCR管中加入6.0μL的变性剂(EDTA 10 mmol·L-1、0.25%二甲苯氰FF、98%甲酰胺、0.25%溴酚兰)离心、充分混匀后，94 ℃变性5 min，然后放入4 ℃冰箱冷却保存。

1.2.4电泳检测

清洗玻璃板后，涂板、灌胶、静置等过程制备6%变性聚丙烯酰胺凝胶等过程将先前制备完成6%PAGE板用恒定功率70 W预电泳30 min后吸取变性扩增产物6μL进行点样，用100 bp DNA Ladder作为参照，电泳时间约60 min，直到溴酚兰距离胶板底部6～7 cm时停止电泳。将胶板卸下并放入固定液(蒸馏水1.8 L+无水乙醇200 mL+冰乙酸20 mL)中在摇床上轻轻震荡15 min后，取出在蒸馏水中漂洗3 min，迅速将板放入避光环境下的染色液中银染15 min，取出后在蒸馏水中速漂7 s，置于显影液(蒸馏水2 L+NaOH 60 g+甲醛10 mL)直至条带清晰后再次转入固定液中终止2 min后，再用蒸馏水漂洗，胶板自然晾干后照相[19]。

1.2.5SSR多态性位点的统计及数据分析

采用0/1赋值法对胶板上扩增出的SSR多态性统计,出现条带记为“1”，无条带的记为“0”，建立“0”和“1”型矩阵，多态性位点百分率(简称P)计算公式：P=(K/N)×100%，其中K为扩增出的多态性条带数目，N为扩增出的条带位点总数[8,18]。

采用NTSYSpc 2.11和Excel 2017软件统计19个供试材料的遗传系数，采用UPGMA(类平均聚类法)及SAS(Statistical Analysis System)、SPSS 22.0等软件作分析。

2 结果与分析

2.1 19份马铃薯品种的DNA提取及质量检测

用基因组提取19个供试材料的DNA，电泳检测条带画质均匀、清晰、无弥散(图1)。表明DNA纯度高，能够满足SSR扩增对供试材料DNA的要求。

2.2 SSR适宜引物的筛选

试验所用130对马铃薯SSR特异引物序列由生物工程有限公司合成。本试验中筛选出10对(表2)适宜引物，扩增条带清晰、多态性丰富、且重复性好。

表2 筛选出SSR适宜引物名称和序列

引物名称正向引物 反向引物 S1745'-TGAGGGTTTTCAGAAAGGGA-3'5'-CATCCTTGCAACAACCTCCT-3'S1685'-CTGCCGCAAAAAGTGAAAAC-3'5'-TGAATGTAGGCCAAATTTTGAA-3'S1805'-ACTGCTGTGGTTGGCGTC-3'5'-ACGGCATAGATTTGGAAGCATC-3'S1515'-GCTGCTAAACACTCAAGCAGAA-3'5'-CAACTACAAGATTCCATCCACAG-3'STM11045'-TGATTCTCTTGCCTACTGTAATCG-3'5'-GAAAGTGGTGTGAAGCTGTGA-3'STM30235'-AAGCTGTTACTTGATTGCTGCA-3'5'-ACGTTAAAGAAGTGAGAGTACGAC-3'STI0055'-CGCAAATCTTCATCCGATTC-3'5'-TCCGGCGGATAATACTTGTT-3'STI0475'-ACTGCTGTGGTTGGCGTC-3'5'-ACGGCATAGATTTGGAAGCATC-3'STI0495'-TCATCACAACGTGACCCC-3'5'-CGGGCTTGAATGATGTGAAGCT-3'STI0525'-ACTTCTGCATCTGGTGAAGC-3'5'-GGTCGGATTCCCAGGTTG-3'

注：M为DNA marker DL 2000，1～19为材料编号。下同。图1 各供试马铃薯品种的DNA检测结果

图2 部分SSR引物的筛选

2.3 19份马铃薯品种SSR-PCR扩增结果

利用筛选出的10对SSR适宜引物对19个供试材料的基因组DNA的PCR扩增(结果见图3和表3)。10对引物共扩增出稳定、清晰的SSR条带163个，其中多态性条带143个，每对引物平均扩增出14.3个，其多态性比率占87.73%，表明各供试材料的多态性丰富。10对适宜引物中多态性条带最多的是引物STI 052，最低的是引物STI 047，其多态性比率分别为100%和75%。各供试品种扩增出指纹图存在一定的差异，每个引物都可以很好的将19个马铃薯品种区分开来，这为马铃薯品种间鉴定提供了可靠的分子依据，为下一步新品种杂交育种奠定基础。

表3 各供试品种的SSR扩增结果

引物 多态性条带扩增条带总数多态性比率/%S174131492.850S168121485.710S180171989.470S151182378.026STM1104151693.750STM3023131681.250STI005141687.500STI04791275.000STI049181994.730STI0521414100.000总和(平均)143163(87.828)

2.4 19份马铃薯品种的遗传距离和聚类分析

19份马铃薯材料间的遗传距离(GD)介于0.241 5～0.704 8之间，平均GD值为0.409 0(表4)。中薯19号与冀张薯8号的遗传距离最大、GD值为0.704 8，其次青薯9号和中薯19号、冀张薯8号和中薯18号的遗传距离分别为0.610 2和0.608 3，说明这些材料间的亲缘关系相对较远；5 p-40与红玫瑰的遗传距离最小，GD值为0.241 5，说明这2个材料间的亲缘关系相对较近。从19个品种的遗传相似系数来看大部分品种的亲缘关系相对较远。在对马铃薯杂交亲本组配时，可选择遗传距离远的亲本，才能获得变异丰富的杂交后代。

图3 19份马铃薯品种的SSR指纹图

表4 19份马铃薯品种的遗传距离矩阵

材料1234567891011121314151617181910.000020.310130.24810.355040.38590.34140.386150.41740.37890.46860.291160.50020.50330.44820.56930.525670.35620.36050.41450.31250.42130.340080.61020.44150.70480.40310.47800.47770.326890.44370.47440.52230.32710.39850.44130.32760.3843100.50870.43020.56430.34250.36640.39870.36230.37520.2986110.53250.43690.50120.45040.40890.38250.30040.45410.43360.4602120.46350.44030.53930.40160.43850.50430.44770.50430.51000.53150.5343130.49910.41030.60830.41100.45390.34740.34130.47800.39850.46350.46710.2699140.47120.37270.53940.39970.48430.48130.38850.49020.41230.38720.44610.45230.3709150.41890.35000.49550.31440.35660.51920.36920.35220.41310.32660.46620.33330.35660.3368160.43940.39430.46090.37320.45000.51620.34800.42740.35220.40120.47380.45890.41550.24150.2794170.51760.35430.54560.34820.49180.46700.40120.35790.38460.43190.43830.44260.39830.34150.29110.2952180.34620.45370.44260.46830.46960.46790.41420.59990.47650.44240.58640.41740.37240.41060.44850.45610.4035190.47120.37270.67590.41620.58960.39960.33130.36400.49080.42230.52020.29550.26920.39420.36760.35120.32630.39320.0000

图4 19份马铃薯品种的SSR聚类结果

遗传多样性是物种适应自然和发生进化的遗传基础。原生群体受遗传迁移、突变和选择等因素的综合影响，其基因频率会在一定的水平上下波动，即遗传多样性会反映在DNA水平上。依据分类前后两相邻的聚类之间差异最大原则，以GD值0.66为基准，将19个马铃薯供试材料分为5类(图4)：青薯9号、冀张薯14、冀张薯8号聚为第1类；第2类为大百花(2191)、冀张薯5号、中薯19号、雪川1310、华颂11；第3类为冀张薯12号、中薯22号、华颂7号；第4类为红玫瑰、希森8号、5 p-40、希森6号；第5类为中薯10号、中薯18号、华颂34、华颂33。

3 结 论

利用筛选出的10对SSR适宜引物对19份马铃薯品种基因组DNA的PCR扩增，得到稳定、清晰的SSR条带163个，其中多态性条带143个，每对引物平均扩增出14.3个，其多态性条带百分率为87.73%，SSR多态性丰富。每对引物都可以很好的将19份马铃薯供试材料区分开来，SSR指纹图谱可为马铃薯品种鉴定提供分子依据。

本研究中马铃薯品种间的遗传距离(GD)介于0.241 5～0.704 8之间，平均GD值为0.409 0。以GD值0.66位基准，可将19个供试马铃薯材料分为五类，分别为：青薯9号、冀张薯14和冀张薯8号为同类；大百花(2191)、冀张薯5号、中薯19号、雪川1310和华颂11为同类；冀张薯12号、中薯22号和华颂7号为同类；红玫瑰、希森8号、5p-40和希森6号为同类；中薯10号、中薯18号、华颂34、华颂33为同类。