西南地区87份小麦品种(系)穗发芽抗性的分子鉴定及筛选

罗永露， 隋建枢， 谢才江， 王 伟， 陈天青， 何庆才

(1.贵州省旱粮研究所， 贵阳 550006； 2.贵州医科大学， 贵阳 550025)

小麦是世界上最重要的农作物，其分布范围及播种面积均居世界第一，具有较高的营养价值，是世界35%人口的主要粮食作物，它的品质和产量直接影响人类的生活水平[1]。小麦也是我国第一粮食作物，最近几年小麦的栽培面积有所下降，而随着人口的稳定增长，我国对小麦的需求也在逐渐增加，因此对小麦的保护和增产研究势在必行。

表1 选用的2个穗发芽抗性标记信息

标记引物名称引物序列(5'-3')片段大小/bp退火温度/℃标记类型参考文献PM19PM19CATGTACTAGTGCACGGATGCTGCCGCTAGTTTCACTACAC117/9960STS[12]Vp1B3Vp1B3TGCTCCTTTCCCAATTGGACCCTCCTGCAGCTCATTG845/569/65264STS[15]

小麦穗发芽是指小麦在收获前遇到阴雨或潮湿环境，导致麦粒在穗上发芽的现象。小麦穗发芽会降低小麦的产量和劣化小麦的品质，而且还可能使其失去商品价值。即使在受轻害的麦粒表面观察不到发芽现象，但是α-淀粉酶活性的提高和胚的萌动也会使面粉的加工品质变劣。在国际上，商品小麦的穗萌率超过5%时就被定为饲料麦，价格大打折扣[2-5]。

穗发芽是一种世界性的自然灾害，据报道，日本、美国、加拿大、巴西、澳大利亚等国都存在此问题，其中以加拿大和澳大利亚尤为明显，每年都不同程度的发生穗发芽，个别年份由穗发芽所造成的损失甚至达总产量的80%。中国黄淮麦区的陕西关中曾多次在小麦成熟期遭逢降雨发生大面积穗发芽的灾情，北方麦区虽无梅雨季节，但春小麦穗发芽也时有发生，西南麦区也是穗发芽发生频率较高的地区，其中贵州较为明显[6-7]。贵州常年温润、相对湿度高达70%，穗发芽频率较其他地区更高。因此，鉴定、筛选、发掘优良抗穗发芽的种质资源，研究其抗性遗传机制及分子机理，已成为小麦种质资源研究和培育抗穗发芽品种的关键问题之一。

目前，PM19-A1基因已被鉴定为与小麦休眠/穗发芽相关基因，且PM19-A1基因所在的4 AL染色体区域最初由Mares等在澳大利亚白皮抗穗发芽品种Halberd以及南非白皮抗穗发芽地方品种AUS 1408和SW 95-50213中初步定位,之后由不同学者共同验证,且靠近该区域的分子标记(Xbarc 170、DuPw 004、Xwmc 650、gpw 2279)在抗穗发芽育种中的有效性也被Singh等[9]和Hickey等[10]所证实。2015年，Barrero等[11]利用多亲本高代自交群体衍生的多重近等基因系，结合RNA测序克隆了位于该区域的抗穗发芽候选基因PM19-A1，并开发了功能标记，该基因存在2种等位变异基因类型，即117 bp与99 bp扩增片段，前者与种子的强休眠相关，后者与种子的弱休眠相关；且研究证明，等位基因类型为PM19-Ala的材料，其平均GI和FS均显著低于等位基因类型为PM19-Alb的材料。有研究开发了位于3 B染色体上与抗穗发芽相关的共显性STS功能标记Vp1B3，在敏感品种中扩增出652 bp的片段，其基因型为Vp1Ba,Vp-1基因是影响小麦穗发芽抗性众多基因中的1个主效基因，具有调节胚发育，促进胚成熟和休眠的功能，该基因目前已定位在小麦第三组同源染色体的长臂上；在抗性品种中能扩增出845 bp和569 bp 2种片段，其基因型分别为Vp-1Bb和Vp-1Bc，研究证明，2种基因型的穗发芽抗性依次为TaVp-1Bb>TaVp-1Bc[14-17]。

DNA分子标记是指能反应生物个体或种群间基因组中某些差异特征的DNA片段。和其它类型的标记相比具有以下优点：

1) 直接以DNA的形式表现，在生物的各组织、发育阶段都能检测到，不受环境影响，不存在表达与否；

2) 多态性高，自然界中存在许多等位变异，不需要人为创造；

3) 数量多，分布于整个基因组；

4) 表现中性，不妨碍目标性状的表达；

5) 许多标记表现为共显性的特点，能够区别开纯合子和杂合子。

因此，分子标记发展迅猛，到目前为止已发展了20多种分子标记[8]。小麦的穗发芽抗性是由多基因控制的复杂性状，并且其性状的表现与环境因素有关，这给育种学家依靠表现型进行穗发芽抗性的选择带来了很大的困难，因此，寻找小麦穗发芽抗性连锁的标记变得十分重要。

船舶造价参照2014—2016年国际新造船市场平均值，ARC6型船舶造价在普通船型的基础上增加30%，船舶折旧方法参照年限平均折旧法，年限25 a，船舶拆船价格参照2014—2016年国际拆船市场平均值。

1 材料与方法

1.1 试验材料

西南麦区小麦主推品种及后备品系共87份，由贵州省农业科学院旱粮研究所提供。

1.2 分子标记

选用2个抗穗发芽标记：PM19、Vp1B3,均由上海生物工程有限公司合成。按说明加入无菌水(pH=8)溶解，然后稀释至浓度为5μmol·L-1，保存于4 ℃冰箱备用。详见表1。

1.3 试验方法

1.3.1CTAB法提取小麦DNA

1) 取幼嫩叶片1～2 g，放入2.0 mL 的Eppendorf管中，加液氮，研磨至粉末状。立即转移粉末至加有提取液的2.0 mL Eppendorf管中，水浴30 min。

表3 PCR扩增程序

引物预变性变形退火延伸循环数终延伸总体系Vp1B395℃95℃58℃72℃3572℃5min1min1min1min10min10μLPM1994℃94℃60℃72℃3572℃5min30s30s30s10min10μL

2) 冷却后，4 ℃，12 000 r·min-1离心10 min。转移上清至无菌2.0 mL Eppendorf管中，加入等体积的酚/氯仿，轻轻颠倒混合，10 min后，4 ℃，12 000 r·min-1离心10 min。

3) 转移上清至无菌2.0 mL Eppendorf管中，加入等体积氯仿/异戊醇，轻轻颠倒混合，10 min后，4 ℃，12 000 r·min-1离心10 min。

4) 转移600μL上清至无菌1.5 mL Eppendorf管中，加入60μL的3 M NaAc，充分混匀后，加入400μL的异丙醇，混匀，-20 ℃沉淀30 min后，4 ℃，12 000 r·min-1离心10 min。

5) 弃上清，沉淀用1 mL 70%乙醇洗涤2次。4 ℃，12 000 r·min-1，离心10 min。

6) 弃上清，在超净台吹干，加入适量的灭菌ddH2O溶解DNA。

1.3.2STS-PCR的扩增与检测

1) PCR反应体系见表2。在0.5 mL离心板上，按照表2中PCR反应体系分别添加溶液，混匀，瞬时离心。加10μL石蜡油覆盖。PCR扩增在Applied Biosystems 9902型PCR仪上进行，PCR扩增程序见表4。PCR扩增完成后，向10μL PCR扩增产物中加入2μL 6×loading buffer,4 000转瞬时离心5 s后轻轻混匀，保存于4 ℃冰箱待用。PCR扩增产物采用8%非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳，用硝酸银对聚丙烯酰胺凝胶上的DNA进行染色。

2 结果与分析

2.1 电泳图片分析

2.1.1PM19STS标记在87份西南麦区小麦主推品种的部分检测结果

分子标记检测结果表明：在87份小麦实验材料中有4份含有片段大小为117 bp的PM-19A1a基因，分别是科成4号、兴0217、蜀麦1763、SW 1747。

2.1.2Vp1B3STS标记在87份西南麦区小麦主推品种的部分检测结果

用于检测Vp1B3基因的引物所显示的目标片段大小为845 bp/569 bp/652 bp 。本实验对87份小麦材料DNA进行PCR扩增，结果(图2)表明，在87份小麦材料中有9份含有片段大小为845 bp的Vp-1Bb基因，分别是黔麦0504、16092、绵麦303、内麦366、川麦604、BL 5002、BL 6007、2017 P 4-2、SW 1747。

表2 PCR反应体系

2.2 PM19、Vp1B基因检测结果

PM19、Vp1B基因检测结果见表4。

表4PM19、Vp1B基因检测

注：“+”表示分别含PM19-A1a、Vp-1Bb基因；“-”表示分别含有PM19-A1b、Vp-1Bc基因；“*”表示未获得扩增片段。

3 讨论与结论

小麦PM19-A1基因所在的4 AL染色体区域由Mares、Halberd等学者定位,之后由不同学者共同验证。该基因存在2种等位变异基因类型，即117 bp与99 bp扩增片段，等位基因类型为PM19-Ala的材料，其平均GI和FS均显著低于等位基因类型为PM19-Alb的材料[13]。Vp1B3基因存在2种等位变异基因类型在抗性品种中能扩增出845 bp和569 bp 2种片段，2种基因型的穗发芽抗性依次为TaVp-1Bb>TaVp-1Bc[14-15]。本研究利用PM19、Vp1B3标记检测了我国西南地区87份小麦品种(系)抗穗发芽特性，发现PM19-A1a、Vp-1Bb这2种抗穗发芽基因型在我国小麦品种资源中的分布频率较低，尤其在现代品种中分布更低，这也可能是近年来我国小麦生产上穗发芽抗性偏低的原因之一。当然，也不能说明简单的筛选出抗穗发芽基因就一定能得到理想中的优异性状，基因间的互作及其与环境的相互作用对于性状的表现影响较大，所以抗穗发芽小麦品种的筛选还需要更多材料和多年数据的进一步验证。

本研究通过PM19和Vp-1B3两个抗穗发芽分子标记，对87份西南地区小麦品种(系)的检测结果发现：科成4号、兴0217、蜀麦1763、黔麦0504、16092、绵麦303、内麦366、川麦604、BL 5002、BL 6007、2017 P 4-2、SW 1747可以作为抗穗发芽育种中抗性亲本的参考选择，其中SW 1747同时具备了PM19-A1a和Vp-1Bb2种抗穗发芽基因片段。其中抗穗发芽单基因比例为9.18%，而抗穗发芽双基因比例为1.49%。为小麦抗穗发芽育种中抗性亲本的选择提供了基因水平的依据，提供小麦抗穗发芽育种亲本的选择范围。