樱桃番茄Cf9基因调控元件预测及同源基因系统发育分析

刘子记， 刘维侠， 牛 玉， 杨 衍

(中国热带农业科学院热带作物品种资源研究所， 海南 儋州 571737)

番茄又名西红柿，在全国各地均有栽培[1]。番茄叶霉病(Fulviafulva(Cooke) Cif)是由褐枝孢菌(Fulviafulva)引起危害番茄生产的一种真菌性病害。该病害自1883年首次在英国被报道以来，逐渐成为番茄生产中发生最普遍最严重的病害之一[2-3]。该病害主要危害叶片，也危害茎、花、果实等[4]。番茄感染叶霉病后，病叶出现椭圆形或不规则褪绿斑，叶背面形成灰褐色或黑褐色霉层，病叶干枯卷曲。该病害引起的产量损失达10%～25%，流行年份达50%以上甚至绝收[5]。

化学药剂难以有效地防治叶霉病，大量用药不仅产生农药残留，也会造成环境污染，影响人类健康和生态安全[6]，而且易导致叶霉菌对常用杀菌剂的敏感性降低，产生抗药性[7]。培育抗病品种是防治叶霉病最为有效的方法。番茄中的抗叶霉病基因主要来源于醋栗番茄、多毛番茄、秘鲁番茄、智利番茄等番茄近缘野生种[8]。随着染色体技术和分子标记技术的发展，有关番茄叶霉病抗性基因的遗传定位研究取得了较大的进展。迄今为止，24个抗叶霉病基因被定位在番茄12条染色体上[9]，但在我国育种工作中应用广泛的抗性基因为Cf9[10-12]。有关Cf9启动子调控元件和同源基因进化特征的研究鲜有报道。因此，该研究拟克隆Cf9基因的上游启动子序列，利用生物信息学方法分析顺式作用元件，另外，通过同源比对构建Cf9同源基因进化树、基因进化折线图和在物种相关网络中的分布图，为进一步阐明Cf9基因的表达调控机制和功能差异奠定基础。

表1Cf9基因启动子顺式作用元件

序号元件名称颜色基序序列个数生物学功能1A-box■CCGTCC1顺式调控元件2ACE■CTAACGTATT1光响应顺式调控元件3Box4■ATTAAT2光响应保守的DNA模块4CAAT-box■CAAT36启动子和增强子普遍存在的顺式调控元件5CCAAT-box■CAACGG1MYBHv1结合位点6CGTCA-motif■CGTCA2茉莉酸甲酯响应顺式调控元件7G-box■CAGACGTGGCA1光响应顺式调控元件8MBS■CAACTG1干旱诱导MYB结合位点9TATA-box■TATA26核心启动子元件10TCA-element□TCAGAAGAGG2水杨酸响应顺式调控元件11TCT-motif■TCTTAC2光响应元件12TGACG-motif■TGACG2茉莉酸甲酯响应顺式调控元件13circadian■CAAAGATATC1昼夜节律控制顺式调控元件

1 材料与方法

1.1 材 料

供试材料为京番红星樱桃番茄，一代杂交种，无限生长型，中早熟，果实高圆尖形，甜度高，硬度好，每穗坐果数12～18个，单果重20～30 g，含有Cf9、Ty 1、Mi-1、Tm 2 a、Sw 5、Ph 3等抗性基因位点。由北京市农林科学院蔬菜研究中心提供。试验于2018年8月在中国热带农业科学院热带作物品种资源研究所试验基地进行，将供试番茄种子播种于育苗盘中，按照常规方法管理，待幼苗长至4叶1心时，摘取叶片采用改良的方法[13]提取番茄材料的基因组DNA。

1.2 方 法

1.2.1Cf9启动子克隆

为了获得Cf9启动子序列，参照GenBankCf9编码序列U15936和番茄基因组序列(https://solgenomics.net/)，从Cf9基因起始密码子下游200 bp内设计引物(正向引物序列(5'-3')：GAAAAGGTGTACCTTATAGCATTTC，反向引物序列(5'-3')：AAGCAAGTTGACAGAGAAAGGTAT)。以樱桃番茄品种京番红星基因组DNA为模板进行PCR扩增，回收目的条带，将目的条带连接、转化，挑选3个阳性克隆，委托广州英韦创津生物科技有限公司进行双端测序。

PCR反应体系包括12μL Premix Taq TM，2μM引物，300 ng模板DNA，终体积为10μL。扩增程序为95 ℃预变性4 min；94 ℃变性50 s，54 ℃退火50 s，72 ℃延伸1 min，共计45个循环；72 ℃终延伸8 min；扩增产物最终保存于4 ℃。20μL扩增产物与2μL UltraPower DNA染料和2μL上样缓冲液混合均匀，经1%琼脂糖凝胶电泳25 min，显色进行带型分析。

1.2.2Cf9启动子调控元件分析

Cf9基因转录起始位点利用在线软件FGENESH进行预测。利用P1antCARE[14]在线启动子预测软件分析Cf9启动子顺式调控元件。

1.2.3Cf9同源基因进化分析

首先通过BLAST同源搜索确定与Cf9同源性最高的基因序列，进而利用Gcorn数据库，结合BLASTP分析结果，计算Cf9同源基因对之间的同源性指数(HI)。基于HI值对Cf9同源基因进行分组，构建系统发育树、基因进化折线图和同源基因在物种相关网络中的分布图。

2 结果与分析

2.1 Cf9基因启动子序列克隆

为了获得Cf9启动子序列，从Cf9起始密码子下游200 bp内设计引物，以京番红星樱桃番茄叶片基因组DNA为模板进行PCR扩增，回收目的片段，经连接、转化、双端测序，共获得1 660 bp的序列，经与Cf9编码序列比对，起始密码子(ATG)位于1 603 bp处，且起始密码子下游编码序列与Cf9编码序列完全相匹配，进一步说明所克隆序列为Cf9启动子序列。通过FGENESH预测Cf9转录起始位点发现，转录起始位点(TSS)位于1 501 bp位点(C)，位于起始密码子上游102 bp位置。选取TSS上游1 500 bp序列进行启动子顺式作用元件预测。

2.2 Cf9基因启动子顺式调控元件分析

Cf9基因启动子序列中存在多个顺式调控元件(图1，表1)。不仅含有启动子核心元件，如RNA聚合酶结合位点TATA-box，调控转录起始频率的CAAT-box。另外，发现Cf9基因启动子区域含有多个光响应元件，如ACE、Box 4、G-box、TCT-motif等。防御与胁迫响应元件，如茉莉酸甲酯响应元件CGTCA-motif和TGACG-motif、水杨酸响应元件TCA-element、干旱诱导MYB结合位点MBS。昼夜节律顺式调控元件，如circadian。分析结果表明，Cf9基因可能受光、胁迫、水杨酸和茉莉酸甲酯等诱导表达。

图2Cf9同源基因系统发育树

2.3 Cf9同源基因进化树构建

由于Gcorn数据库中无Cf9基因序列，为了进行Cf9同源基因进化分析，首先利用NCBI数据库(https://www.ncbi.nlm.nih.gov)基于Cf9基因序列U 15936进行同源比对，与潘那利番茄XM_015201005.2的序列一致性最高，达93.15%，XM_015201005.2对应的基因ID为LOC 107002828，对应的蛋白质ID为XP_015056491，利用XP_015056491基于Gcorn数据库进一步开展Cf9同源基因进化分析。基于XP_015056491和与其同源性最高的其他20条蛋白质序列构建了Cf9同源基因系统发育树。结果(图2)表明，XP_015056491与潘那利番茄XP_015056492同源性最高，同源性指数为1.00，其次与番茄XP_004228442蛋白同源性指数为0.87，与马铃薯XP_006354136蛋白的同源性指数为0.73，与辣椒XP_016552405蛋白的同源性指数为0.69，与烟草XP_016474183蛋白的同源性指数为0.68。

2.4 Cf9同源基因进化分析

为了简化进化树的特征，构建了Cf9同源基因进化折线图。当同源指数为1.00时，共包括3条蛋白序列，属于旁系同源基因。同源指数为0.88时，潘那利番茄和普通番茄含有Cf9同源基因，属于直系同源基因。同源指数为0.77时，潘那利番茄、普通番茄和马铃薯含有Cf9同源基因，同源基因既包括旁系同源基因，也包括直系同源基因。同源指数为0.72时，潘那利番茄、普通番茄、马铃薯和辣椒含有Cf9同源基因，同源基因既包括旁系同源基因，也包括直系同源基因(图3)。在物种相关网络中，节点代表物种，蓝色节点代表该物种含有Cf9同源基因，当同源指数为0.65时，由图4可知，潘那利番茄、普通番茄、马铃薯、辣椒、烟草、美花烟草均含有Cf9同源基因。

图3 Cf9同源基因的进化折线图

3 讨 论

番茄叶霉病是一种世界性病害[15]，随着番茄种植规模的扩大和设施栽培的发展，叶霉病的危害日趋严重，一旦发病迅速蔓延，严重影响番茄的产量和品质[16]，已成为制约番茄生产的重要因素[17-18]。利用抗病基因培育抗病品种是防治叶霉病最为经济、有效的方法[19]。探索基因表达调控方式对于合理利用抗病基因具有重要作用。

图4 Cf9同源基因在物种间相关网路的分布

转录调控是真核生物基因表达的主要调控方式，通过转录因子和顺式作用元件之间的相互作用来实现[20]。启动子是转录水平调控基因表达的重要部分。本研究选取番茄抗叶霉病Cf9基因TSS上游1 500 bp的序列作为启动子序列进行了顺式调控元件分析，分析结果发现该启动子除含有CAAT-box和TATA-box等基本的顺式调控元件外，还含有多个光响应元件，进而推测光在Cf9基因表达调控过程中具有重要作用。Cf9启动子区域含有茉莉酸甲酯响应元件、水杨酸响应元件，这可能与Cf9抗真菌活性相关。另外Cf9启动子区域还含有干旱诱导MYB结合位点，因此推测，外界环境的变化可能会通过这些顺式作用元件激活Cf9基因的表达，从而调控番茄对逆境的防御。

Cf9同源基因系统进化分析结果表明，番茄Cf9同源蛋白XP_015056491与马铃薯XP_006354136蛋白的同源性指数较高，其次为辣椒和烟草。这进一步说明番茄与马铃薯的亲缘关系最近，其次为辣椒、烟草。这与NCBI分类数据库(https://www.ncbi.nlm.nih.gov/)的结果一致。Cf9在茄科作物中的同源基因既包括旁系同源基因，也包括直系同源基因。