泛素特异性蛋白酶2促进心肌肥厚发生和发展的作用△

高伟年，赵曙光，郭 娜，陈子英，张文立，闫 芳

（1.河北医科大学第二医院心脏大血管外科，石家庄 050000；2.石家庄市中医院心病一科，石家庄 050051）

心脏主要由心肌细胞，非心肌细胞（成纤维细胞、内皮细胞、肥大细胞和血管平滑肌细胞）以及细胞外基质组成［1-2］。心肌肥厚是常见的心脏病理表现，长期心肌肥厚最终会导致心力衰竭的发生［3-4］。心肌肥厚是一个复杂的病理生理过程，虽然目前发现许多生物学过程都与心肌肥厚的发展密切相关［5-6］，但是心肌肥厚发生的机制尚不清楚。泛素特异性蛋白酶2（ubiquitin specific protease 2，USP2）是去泛素化酶家族中的重要一员，所编码的蛋白活性对肿瘤坏死因子-α（TNF-α）诱导核因子-κB（NF-κB）信号通路的持续激活是必须［7-8］。已有研究表明，USP2可与脂肪酸合酶（FAS，抑制细胞凋亡蛋白），小鼠双微体基因（MDM2），细胞周期蛋白D1等蛋白相互结合，并使这些蛋白去泛素化从而抑制其降解［9-11］。已有研究表明，USP2可以与心肌细胞膜上的钙通道蛋白KCNQ1相互结合，调节心肌节律［12］。但直到目前为止，USP2在心肌肥厚中的作用尚不清楚，因此，本研究旨在研究USP2在心肌肥厚中的作用。

1 材料和方法

1.1 材 料

无特定病原体（SPF）级的C57BL/6雄性小鼠10只，鼠龄9～11周，体质量22～25 g，由河北医科大学实验动物中心提供（SCXK（京）-2018-004）。无特定病原体级Sprague-Dawley（SD）大鼠20只，出生时间为72 h，由河北医科大学实验动物中心提供（SCXK（冀）-2018-004）。无菌手术在河北省实验动物中心进行［SYXK（冀）2018-008］。实验过程对实验动物按照3R原则给与人道的关怀。实验试剂：异丙肾上腺素（isoproterenol，ISO）（济南科汇药业有限公司），干扰USP2腺病毒（上海吉凯基因化学技术有限公司），cDNA反转录试剂盒（北京天根生物），SuperReal荧光定量预混试剂（北京天根生物），极超敏ECL化学发光试剂盒（北京天根生物），RIPA Lysis and Extraction Buffer（美国赛默飞），蛋白酶抑制剂（美国赛默飞），TRIzol（美国赛默飞），磷酸酶抑制剂（美国赛默飞），USP2鼠抗人单克隆抗体（上海艾博抗），GAPDH鼠抗人单克隆抗体（上海艾博抗），BCA蛋白定量试剂盒（上海碧云天），辣根酶标记山羊抗兔IgG（上海碧云天）。

1.2 主要仪器

实时定量聚合酶链反应（polymerase chain reaction，PCR）仪（美国Bio-Rad），高速冷冻离心机（德国Eppendorf），冷冻冷藏两用冰箱（中国海尔），-80℃超低温冰箱（美国赛默飞），转膜仪（北京六一），电泳仪（北京六一）。

1.3 异丙肾上腺素诱导的心肌肥厚小鼠模型的建立

实验分为心肌肥厚组及对照组。将配置好的ISO（8.7 mg·kg-1·d-1）注入渗透压微泵，放置于心肌肥厚组小鼠背部皮下，持续处理7 d。对照组小鼠持续给予0.9%氯化钠溶液处理7 d。

1.4 分离大鼠原代心肌细胞

根据参考文献［13］，取新生乳大鼠心脏，眼科剪将心脏剪成小碎块，0.2%胰蛋白酶中重复消化，1 200 r/min离心，15%胎牛血清的DMEM（Dulbecco Eagle's minimum essential medium）培养基悬浮沉淀，300目网过滤，预贴壁1 h后，将上清重新转移至新的培养皿中。

1.5 ShRNA腺病毒感染

将USP2干扰及其对照腺病毒加入原代心肌细胞中，感染48 h后收集细胞进行后续实验。USP2干扰序列为：5'-GGAGGCAGTGGATTTCCTTAT-3'，对照干扰序列为：5'-TTCTCCGAACGTGTCACGT-3'。

1.6 荧光定量反转录聚合酶链反应

用TRIzol法提取细胞总RNA，合成cDNA。PCR扩增检测目的基因mRNA的表达水平，GAPDH为内参基因，分别设3个复孔。本研究中所用引物如表1所示。

表1 本研究中所用引物

1.7 Western blot检测方法

磷酸盐缓冲液（phosphate buffered saline，PBS）清洗细胞2次，加入细胞裂解液RIPA（radio immunoprecipitation assay）冰上裂解20 min。4℃，12 000 r/min离心15 min后收集上清。10%十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶（SDS-PAGE）电泳分离后将蛋白转印于聚偏二氟乙烯膜（polyvinylidene fluoride，PVDF）膜。5%脱脂牛奶封闭1 h，分别加入一抗和二抗孵育，显影。

1.8 细胞面积的计算

原代心肌细胞使用α-actinin免疫荧光染色后，Image J软件分析心肌细胞的面积。每组随机测量10个细胞计算面积，取均值。

1.9 统计学分析

2 结果

2.1 小鼠心肌肥厚模型建立的检测结果

与对照组相比，ISO处理后的小鼠心脏质量与体质量比值显著升高（图1A），可见ISO诱导的小鼠心脏质量增加，发生心肌肥厚。荧光定量反转录聚合酶链反应（quantitative reverse transcription polymerase chain reaction，qRT-PCR）检测心肌肥厚关键基因表达水平的结果显示，与对照组相比，ISO处理组心脏组织中ANP（t=27.11，P＜0.001）、BNP（t=17.75，P＜0.001）及MYH7（t=15.34，P＜0.001）基因的mRNA水平显著增加（图1B）。说明小鼠心肌肥厚模型建立成功［14］。

2.2 对照组与异丙肾上腺素处理组小鼠泛素特异性蛋白酶2表达比较

与对照组小鼠比较，ISO处理组小鼠的USP2的mRNA及蛋白表达水平均显著上调，差异有统计学意义（图2，t=5.83，P＜0.01）。

2.3 对照组和干扰组大鼠泛素特异性蛋白酶2基因mRNA及蛋白表达量比较

腺病毒介导的RNA干扰技术对USP2基因的干扰效果如图3所示，与对照组大鼠比较，USP2干扰组大鼠USP2基因mRNA和蛋白的表达量显著下调，差异有统计学意义（t=10.53，P＜0.001）。

2.4 干扰泛素特异性蛋白酶2的表达抑制异丙肾上腺素引起的心肌肥厚反应

在ISO刺激的原代心肌细胞中，抑制USP2的表达可以显著减小心肌细胞的面积（图4A，AdshCtrl PBSvs.ISO，t=32.23，P＜0.001；ISO Ad-shCtrlvs.ISO Ad-shUSP2，t=24.23，P＜0.001），同时也可以抑制ISO上调的心肌肥厚标志基因ANP（图4B，Ad-shCtrl PBSvs.ISO，t=21.42，P＜0.001；ISO AdshCtrlvs.ISO Ad-shUSP2，t=14.56，P＜0.001）和BNP（图4C，Ad-shCtrl PBSvs.ISO，t=22.67，P＜0.001；

图1 对照组与ISO处理组小鼠心脏质量与体质量比值及ANP，BNP和MYH7表达的比较（A：对照组与ISO处理组小鼠心脏质量与体质量比值比较；B：对照组与ISO处理组小鼠qRT-PCR检测的ANP，BNP和MYH7表达比较）

图2 对照组与ISO处理组小鼠USP2表达的比较（A：对照组与ISO处理组小鼠qRT-PCR检测USP2的mRNA表达量比较；B：对照组和ISO处理组小鼠Western blotting检测的USP2蛋白表达量比较）

图3 对照组和USP2干扰组大鼠USP2基因mRNA及蛋白表达量比较（A：对照组和USP2干扰组大鼠qRT-PCR检测的USP2 mRNA表达量比较；B：对照组和USP2干扰组大鼠Western blotting检测USP2的蛋白表达量比较）

ISO Ad-shCtrlvs.ISO Ad-shUSP2，t=18.62，P＜0.001）基因表达。在对照组中干扰USP2的表达对细胞大小，ANP、BNP及MYH7基因的表达并无显著影响。这些结果表明干扰USP2的表达能够显著抑制ISO诱导的心肌肥厚反应。

3 讨论

图4 干扰USP2可以抑制心肌肥厚的发生（A：干扰USP2可以显著抑制ISO诱导的心肌细胞肥大；B：干扰USP2可以显著抑制ISO诱导的ANP基因的上调；C：干扰USP2可以显著抑制ISO诱导的BNP基因的上调）

心肌肥厚是心肌细胞应对内外刺激而增加心脏泵血功能和减少心室壁张力的一种适应性生长［15-16］。心肌肥厚包括生理性肥厚和病理性肥厚，虽然两者均表现为心脏大小的增加，但是病理性肥厚伴随心肌细胞的凋亡和坏死，细胞外基质过度沉积导致心肌纤维化，心脏功能障碍和心力衰竭乃至猝死风险的增加［17-18］。

本研究发现，USP2在ISO诱导的肥厚小鼠中的表达显著增加，用腺病毒敲低USP2的表达能够抑制ISO诱导的心肌细胞大小，抑制ISO诱导的肥厚基因的表达。心肌肥厚过程中会发生蛋白合成的增加和基因表达模式的改变。心肌肥厚过程中胚胎期基因，包括ANP，β-肌球蛋白重链等，表达显著增加。同时心肌肥厚过程中也会伴随着一些蛋白表达水平的下调。本研究使用ANP，BNP和MYH7作为判断心肌肥厚的基因指标，ISO诱导可以促进上述3种基因的表达水平显著升高，而干扰USP2可以抑制ISO对上述3种基因的诱导作用，提示USP2参与心肌肥厚的发生和发展。

USP2定位于人的11q23.3号染色体上，共有17个外显子。USP2基因可以产生7个选择性剪接变体，其中5个可以编码蛋白［19］。已有研究表明，USP2可与多种蛋白相互作用并对其进行去泛素化，影响蛋白的稳定性；例如USP2可以与脂肪酸合成酶相互作用，从而促进脂肪酸合酶的半衰期，稳定脂肪酸合酶［9］，而沉默USP2导致细胞凋亡［20］。而作为机体耗能最多的一个器官，心肌肥厚过程中心肌代谢模式发生转变，脂肪酸利用减少，葡萄糖摄取及糖酵解增加［21］，因此干扰USP2可能通过降低脂肪酸合酶的稳定性，降低心肌脂肪酸的合成，从而参与心肌肥厚过程中心肌的代谢方式。心肌细胞肥厚过程中，心肌细胞会发生凋亡和坏死，由于绝大多数的心肌细胞在出生后就失去增殖能力，死亡的心肌细胞会由大量的细胞外基质替代［22］，过量的细胞外基质导致瘢痕或纤维化的形成，最终导致心律失常［23］。已有研究表明，USP2可以与心肌细胞膜上的钙通道蛋白KCNQ1相互结合，调节心肌细胞节律［12］，提示USP2可能通过调节心肌细胞节律参与心肌肥厚的发生。虽然本研究发现USP2参与心肌肥厚的发生和发展，但USP2如何发挥功能尚待进一步探讨。USP2作为去泛素蛋白酶家族成员，是否通过调控上述蛋白稳定性或者调节其他靶蛋白的泛素化发挥功能尚待进一步探讨。

综上，本研究发现ISO诱导心肌肥厚过程中，USP2表达上升，靶向敲低USP2可以有效的抑制ISO诱导的心肌肥厚。但USP2参与心肌肥厚的发生和发展的详细作用机制有待深入研究。心肌肥厚的发生与多种因素有关，但机制尚不清楚。目前，对于心肌肥厚导致的心力衰竭临床上缺乏高效的防治方法。因此，本研究将为防治心肌肥厚以及心肌肥厚所致的心力衰竭提供实验室工作基础和理论依据，并为防治心力衰竭提供新的药物作用靶点。