刺五加多糖纳米乳对小白鼠的急性毒性和细胞毒性研究

李向辉， 康 宇， 尉 斌， 闫盼盼， 刘永录*

（1.河南牧业经济学院动物医学院，河南郑州 450046；2.华中农业大学动物医学院，湖北武汉430070）

刺五加多糖（ASPS）是一种天然来源的免疫多糖，安全、无毒，具有免疫刺激活性，能诱导并增强机体的细胞免疫和体液免疫应答，可作为一种免疫增强剂提高机体的免疫反应 （杨侃侃等，2013）。目前，已经从剌五加中分离提取出了数种由果糖、葡萄糖、阿拉伯糖等组成的多糖组分。研究表明，刺五加多糖具有良好的免疫调节、抗肿瘤、抗感染、解毒等功效（段雪磊等，2015；刘树民等，2014）。与其他植物多糖一样，刺五加多糖也存在机体代谢快和给药量大的问题；另外，还有部分的碱溶性多糖不容易被吸收。因此，提高刺五加多糖的生物利用度、缓释性及其在体内的吸收、免疫效果显得尤为重要。

纳米乳（NE)是一种由表面活性剂、助表面活性剂、油相、水相在适当比例下经乳化形成的一种粒径为1~100 nm的乳剂，具有粒径小、靶向性强、生物利用度高、能提高难溶性药物的溶解度等优点。

刺五加多糖纳米乳（ASPS-NE)是本课题组采用纳米乳化技术研制成功的一种纳米制剂，有望为兽医临床提供一种安全、有效的免疫增强剂。为进一步确定刺五加多糖纳米乳的安全性，本研究进行了刺五加多糖纳米乳对小白鼠的急性毒性试验和对L929细胞的细胞毒性试验，以期为刺五加多糖纳米乳在兽医临床上的合理安全应用提供参考。

1 材料与方法

1.1 试验材料

1.1.1 主要药品、试剂及设备 刺五加多糖，产地辽宁沈阳，由河南牧业经济学院制药工程学院药理实验室分离提取；无水乙醇、吐温-80、司盘-80（天津市科密欧化学试剂有限公司）；液体石蜡、甘油（天津市德恩化学试剂有限公司）；肉豆蔻酸异丙脂（浙江物美生物科技有限公司）；氯化钠注射液 （山东鲁抗辰欣药业有限公司）；10%的胎牛血清（美国Sigma公司）；胰酶、RPMI-1640培养液、DMSO（北京索莱宝科技有限公司）；CCK-8（日本东仁公司)；蒸馏水，实验室自制。

酶标仪（LUX型，美国Thermo Fisher)；倒置生物显微镜 （BX43型，日本奥林巴斯)；离心机（5424R型，德国Eppendorf）；独立送风隔离笼（IR-20 型，苏州冯氏）；CO2培养箱（371 型，美国Thermo Scientific)；超净工作台（SW-CJ-2FD 型，苏州净化）。

1.1.2 试验动物 Ballc/c小鼠 （体重18~22 g，雌雄各半），郑州大学实验动物中心提供，合格证：SCXK（豫)2017-0001；小白鼠常规饲养管理，温度18~22℃，相对湿度50%~70%；L929细胞，中科院上海细胞库提供。

1.2 试验方法

1.2.1 刺五加多糖纳米乳和空白纳米乳的制备按照袁珍珍等（2017）、宋冠男等（2013）和李树鹏等（2011）的方法制备刺五加多糖纳米乳和空白纳米乳。以吐温-80、司盘-80为表面活性剂，无水乙醇为助表面活性剂，石蜡油和IPM为油相，使吐温-80：司盘-80：无水乙醇：甘油：石蜡油：IPM：水溶液=12:4:1:1:4:3:1（质量比）。将适量的吐温-80、司盘-80、无水乙醇、甘油与适量的液体石蜡、IPM充分混合，然后在磁力搅拌器上搅拌，并逐滴滴加ASPS灭菌水溶液 （空白纳米乳用蒸馏水代替），直至形成澄清透明的纳米乳。制备好的纳米乳，放置 12 h，分装熔封于充氮安瓿瓶内，流通蒸汽灭菌半个小时即可。制得的纳米乳为淡黄色透明澄清液体，平均粒径为30.6 nm，ASPS含量为25.06 mg/mL。

1.2.2 小白鼠急性毒性试验 预试验：按简化寇氏法设计试验 （曹发昊等，2014；杨雪峰等，2011）。先计算出引起小鼠100%死亡和无死亡的剂量。98只小白鼠随机分为空白纳米乳组和ASPS-NE组，每组各49只，雌雄各半，各分为7个剂量组，每个剂量组7只小鼠，分别注射不同浓度的药液 （每20 g体重给药量分别为0.125、0.25、0.5、0.75、1.0、1.25、1.50 mL）， 注射之前禁食不禁水12 h，采用肌肉注射的方法，给药后连续观察7 d，找出刺五加多糖纳米乳能使小鼠全部死亡的最小剂量（Dm）和能使小鼠全部存活的最大剂量（Dn）。

正式试验：参照预试验结果设计正式试验。98只小白鼠随机分为空白纳米乳组和ASPS-NE组，每组各49只，雌雄各半，各分为7个剂量组，每个剂量组7只小鼠，用药剂量换算成刺五加多糖 分 别 为 625、875、1125、1375、1625、1875、2125 mg/（kg.bw)。根据李向辉等（2013）的计算方法算出各组小白鼠的用药量，以此药量对小白鼠进行肌肉注射。注射给药后连续7 d观察小鼠的精神状况、行为活动、粪便等情况，记录各组的死亡数。最后剖检各组小鼠，观察内脏器官有无病变。将试验结果用Bliss软件进行分析，得出空白纳米乳和刺五加多糖纳米乳的LD50和95%的可信限。根据文献（夏鹏飞等，2017）的分级标准，进行急性毒性分级，并评价刺五加多糖纳米乳急性毒性的强弱。

1.2.3 L929细胞的细胞毒性试验 将小鼠成纤维细胞（L929细胞）传代后取对数生长期细胞制成1×105个/mL浓度的细胞悬液接种96孔培养板，并将细胞分为正常对照、阳性对照、多糖溶液、空白纳米乳和ASPS-NE 5个组，ASPS-NE组、阳性对照组、空白纳米乳组和多糖溶液组每孔加100μL细胞悬液，正常对照组只加100μL RPMI-1640培养液，每组三个重复，待细胞贴壁生长后去除原培养液，阳性对照组加DMSO 100μL，空白纳米乳组、刺五加多糖纳米乳组、多糖溶液组各加入不同浓度梯度的受试药物100μL，使各组浓 度 为 250、125、62.5、31.25、15.625、7.8125、3.9 μg/mL，于37℃、5%CO2培养箱中培养44 h左右后，倒置显微镜下观察细胞的生长状态及形态，然后每孔加10μL CCK-8，孵育2 h左右，用酶标仪于450 nm测各孔的OD值，参考刘昌孝等（2006）的方法计算细胞毒性分级（RGR）。

RGR/%=（试验组OD值-空白对照组OD值）/（正常对照组OD-空白对照组OD）；

细胞毒性分级（RGR）标准为：0级（RGR≥100)或 1级（RGR 为 75~99）为合格。 2级（RGR为50~74）视细胞形态情况而定，3到5级（RGR为0~49）为不合格。

2 结果与分析

2.1 急性毒性试验 小鼠肌肉注射给药后，高剂量组小鼠1~2 h内出现呼吸困难、震颤惊厥、运动失调等症状，约7 h陆续有死亡小鼠，其他剂量组小鼠在7 d内都有部分小鼠死亡，剖检后观察内脏未见明显病理变化，存活小鼠逐渐恢复正常。

预试验结果：经预试验发现，ASPS-NE组和空白纳米乳组的Dm为1.72 g/mL、Dn为0.32 g/mL，按Dm量注射小鼠全部死亡，按Dn剂量注射小鼠均未出现死亡。正式试验结果：采用简化寇氏法 （杨慧等，2019）计算得空白纳米乳的LD50为1008.2 mg/（kg·bw） ，95% 可 信 限 为 777.04~1198.2 mg/（kg·bw）；刺五加多糖纳米乳的 LD50为1157 mg/（kg·bw），95%的可信限为 949~1347.2 mg/（kg·bw）。具体试验结果见表 1。

2.2 细胞毒性试验 如表2所示，正常对照组RGR为102、0级毒、合格；阳性对照组RGR为22.7、4级毒、属于重毒；空白纳米乳组在剂量≥15.625μg/mL时RGR≤99、1级毒、合格；当浓度≤7.8125μg/mL时，RGR≥99、0级毒、 合格；ASPS药液组在浓度≥62.5μg/mL时RGR≤99、1级毒、合格；当浓度≤31.25μg/mL时RGR≥100、0级毒、合格；ASPS-NE组在浓度≥62.5μg/mL时RGR≤99、1级毒、合格；当浓度≤31.25μg/mL时RGR≥100、0级毒、合格；结果表明与空白纳米乳和正常对照组相比，ASPS-NE组毒性低，在低于31.25μg/mL浓度范围内ASPS-NE对细胞为0级毒。

3 小结与讨论

药物的安全性评价是研发新药的一个重要环节，安全性评价的目的在于了解药物单次或短时间多次给药后，动物产生的毒性反应及其严重程度，为临床安全用药及检测提供参考。

本研究在刺五加多糖纳米乳急性毒性预试验中发现，空白纳米乳与刺五加多糖纳米乳的Dm与Dn相同，均为1.72 g/mL和0.32 mg/mL，在正式试验中，刺五加多糖纳米乳的半数致死量为1157 mg/（kg·bw)，而空白纳米乳为 1008.2 mg/（kg·bw)，根据急性毒性试验分级标准（彭丽等，2019；邹绍宇等，2019），结果表明，空白纳米乳和ASPS-NE为低毒药物。细胞毒性试验结果表明ASPS-NE组在浓度≥62.5μg/mL时RGR≤99，为1级毒；当浓度≤31.25μg/mL时RGR≥100，0级毒，说明当浓度≤250μg/mL时ASPS-NE对细胞没有毒性，并且ASPS-NE比空白纳米乳和正常对照组毒性更低，说明刺五加多糖纳米乳降低了毒性。

表1 空白纳米乳、ASPS-NE急性毒性试验结果

表2 各用药组L929成纤维细胞的相对增值率RGR及毒性级数

经过对刺五加多糖纳米乳急性毒性、细胞毒性等方面的研究，表明ASPS-NE毒性低，LD50为1157 mg/（kg·bw），而空白纳米乳的 LD50为 1008.2 mg/（kg·bw）。另外，刺五加多糖纳米乳细胞毒性低，在药物浓度≤31.25μg/mL时为0级毒，对内脏器官无病理损害，在兽医临床上使用安全，具有很高的临床使用价值。