小鼠营养性肥胖对其生殖器官中mPRα、mPRβ、mPRγ基因表达的影响

邓凯伟，张亦云

（信阳农林学院，河南信阳 464000）

肥胖是体脂过量蓄积所致的临床综合征，在细胞水平的解释是脂肪细胞数目的增加和体积的增大（陈粉粉等，2012）。肥胖严重威胁着动物的健康，其发病率在我国畜牧业有逐年涨高的趋势（Yuling 等，2014）。 王辰等（2015）研究表明，肥胖可通过影响卵巢孕激素受体mPRα发育变化，引起小鼠假发情、产仔数减少和流产等繁殖障碍。但目前国内外对肥胖可能导致动物的生殖器官子宫、卵巢、输卵管以及孕酮膜受体mPRα、mPRβ、mPRγ表达这方面的研究相对较少，试验通过构建小鼠的营养性肥胖模型，测定小鼠生殖器官卵巢、子宫、输卵管重量的变化，采用RT-PCR技术对小鼠子宫、卵巢和输卵管中孕酮膜受体mPRα、mPRβ、mPRγ的基因表达量进行分析，从而探究营养性肥胖对小鼠生殖器官及孕酮膜受体基因表达的影响，为研究肥胖通过调控小鼠生殖器官体重对生殖性能的影响机制进行初步的探索。

1 材料与方法

1.1 试验饲料 高脂饲料和普通饲料均购自江苏省协同医药生物工程有限责任公司。高脂饲料和普通饲料的饲料配方见表1。

表1 小鼠饲料配方g/100g

1.2 试验主要试剂 RNA提取液 （批号为G3013）， 购自 Servicebio； 异丙醇 （批号为80109218）、无水乙醇（货号为 10009218），均购自国药集团化学试剂有限公司；矿物油、TritonX-100（T8200），均购自美国 SIGMA公司；胎牛血清（批号为18070301），购自浙江天杭生物技术股份有限公司。

1.3 试验主要仪器 电子天平 （型号为AN 1321），购自上海民桥精密科学仪器有限公司；洁净工作台（型号为SW-CJ-1D），购自广州瑞智净化设备有限公司；CO2细胞培养箱 （型号为HH·CPT01A），购自上海一恒科技有限公司；台式高速冷冻型微量离心机 （型号为D3024R），购自DragonLab；离心管、TIP 头，均购自 Axygen Biosciences。

1.4 试验动物分组与饲养 选择4～5周龄、体重13～15 g昆明白雄性小鼠20只，雌性小鼠40只（购自信阳职业技术学院），饲养在室温22～25℃，湿度50%～70%的房间，自由饮水。将雌鼠先用普通饲料饲养1周适应后，随机选出20只，继续喂养普通饲料，设为对照组。剩余20只开始饲喂高脂饲料，设为高脂组。每周定期对小鼠进行一次空腹体重测量。

1.5 子宫、卵巢、输卵管的收集 饲养8周，小鼠营养性肥胖模型建立后，将雌鼠和雄鼠一对一合笼自由配种，受精三天后，以颈椎脱臼法处死雌鼠，分别取出子宫、输卵管和卵巢，装入离心管中，放在-80℃的干冰中保存。

1.6 定量PCR分析卵巢、子宫、输卵管中mPRα、mPRβ和mPRγ的基因表达量

1.6.1 引物设计 根据GenBank上登录的小鼠mPRα、mPRβ、mPRγ基因序列， 应用 Oligo7.0和Primer6软件设计引物，引物由武汉塞维尔生物科技有限公司合成。引物相关信息见表2。

表2 PCR引物序列设计

1.6.2 总RNA抽提 采用TRIZOL Reagent试剂盒提取总RNA。

1.6.3 反转录 取2μg总RNA放置于PCR管中，加入1μL Oligo（dT），加去离子水直至12μL。 放于PCR仪上65℃保温5 min，快速置于冰上冷却。然后依次加入4μL 5×Reaction Buffer，2μL 10 mM dNTP Mix，1 μL RiboLock RNAase抑制剂和1μL RevertAi M-MuLV逆转录酶，用移液枪充分混匀。放于PCR仪上42℃保温60 min，最后在70℃水浴中保温5 min灭活反转录酶。

1.6.4 定量PCR 取0.2 mL PCR管，配制如表3，反转录产物每个配制3管。PCR扩增过程如表4。

表3 反应体系所需反应物及体积 μL

表4 PCR扩增过程

1.6.5 结果处理 ΔΔCT法：

A=CT（目的基因，待测样本)-CT（内标基因，待测样本）；

B=CT（目的基因，对照样本)-CT（内标基因，对照样本）；

K=A-B；

表达倍数=2-K。

1.7 数据统计分析 采用SPSS 21.0软件对试验所得数据进行统计分析，结果用 “平均值±标准差”表示。采用t检验进行差异显著分析，以P＜0.05为差异显著，P＜0.01为差异极显著，即有统计学意义。

2 结果与分析

2.1 小鼠肥胖模型建立结果 由表5可知，小鼠喂养6周后，高脂组小鼠平均体重与对照组相比显著提高 （P＜0.05），8周后，极显著提高 （P＜0.01），说明小鼠营养性肥胖模型建模成功。

表5 小鼠体重记录表g

2.2 小鼠子宫、卵巢体重测定 如表6所示，通过连续8周饲喂高脂饲料后，高脂组小鼠子宫和卵巢体重与对照组相比显著提高（P＜0.05）。

表6 小鼠子宫、卵巢体重g

2.3 mPRα、mPRβ、mPRγ在子宫、输卵管和卵巢的表达

2.3.1 mPRα在卵巢、子宫、输卵管的基因表达量由图1可知，高脂组小鼠卵巢中mPRα的表达量与对照组相比差异不显著（P＞0.05）；高脂组小鼠子宫和输卵管中mPRα表达量与对照组相比显著降低（P ＜ 0.05）。

2.3.2 mPRβ在卵巢、子宫、输卵管的基因表达量由图2可知，在卵巢、子宫和输卵管中，对照组与肥胖高脂组小鼠相比，mPRβ的基因表达量均差异不显著（P ＞ 0.05）。

2.3.3 mPRγ在卵巢、子宫、输卵管的基因表达量由图3可知，在卵巢和输卵管中，对照组与高脂组相比mPRγ的基因表达量有显著差异（P＜0.05）；在子宫中，对照组和高脂组中mPRγ的基因表达量差异不显著（P＞0.05）。

3 讨论

崔立坤（2011）研究表明，肥胖对生殖系统有严重威胁。在畜牧生产中，肥胖通过影响生殖器官变化而对生殖性能产生一定影响。近年来，通过建立小鼠肥胖模型来探究肥胖对小鼠生殖机能的影响也逐渐成为研究的热点。本试验通过连续8周饲喂高脂饲料后，与普通对照小鼠相比体重差异极显著 （P＜0.01），小鼠营养性肥胖模型建模成功，进行营养性肥胖对小鼠生殖器官及孕酮膜受体基因表达的影响研究。

孕酮膜受体的表达、分布及功能在鱼类及两栖类中研究较为深入（杨梅等，2010）。在哺乳动物生殖系统表达、分布及功能研究较少。孕酮膜受体mPRα、mPRβ和mPRγ，具有参与孕激素快速调节的作用（林翠英等，2018）。mPRα是最早被发现且研究最为深入的孕酮膜受体。mPRα主要表达在生殖器官，包括卵巢和睾丸。mPRα在调节卵母细胞减数分裂成熟过程起重要作用，其能快速诱导卵母细胞减数分裂，抑制颗粒细胞调亡。Hagiwara等 （2016)研究发现，卵巢和排卵前滤泡mPRα和mPRγ的转录始终保持相对稳定水平。正常受孕以后 ，体内孕激素分泌持续增加，通过与子宫内膜发生特异性结合，发挥特异性的生理效应，导致子宫内膜发生生殖障碍 （姚若进，2011）。本试验中，通过对小鼠生殖系统mPRα、mPRβ 和 mPRγ 表达的研究，mPRα、mPRβ 和mPRγ在高脂组和普通组小鼠子宫、卵巢和输卵管中均有表达。高脂小鼠的子宫和输卵管中mPRα基因表达量显著低于对照组小鼠 （P＜0.05）；高脂组小鼠巢中mPRα表达和对照组差异不显著（P＞0.05）。高脂组子宫、卵巢和输卵管中mPRβ表达量与普通对照组相比差异不显著（P＞0.05）。高脂组卵巢和输卵管中mPRγ表达量显著低于对照组（P＜0.05），高脂组小鼠子宫中mPRγ表达量和对照组相比差异不显著（P＞0.05）。

mPRα、mPRβ和mPRγ这三个基因表达量在子宫、卵巢和输卵管中均是对照组高于肥胖高脂组。结合在试验中，小鼠营养性肥胖模型构建后，小鼠生殖器官如子宫、卵巢、输卵管体重和对照普通组相比增加，并且达到差异显著水平 （P＜0.05）。生殖器官体重变化和孕酮膜受体基因表达结果显示，在小鼠生殖系统中，营养性肥胖通过对小鼠生殖器官重量的改变，从而导致小鼠生殖性能下降以及降低孕酮膜受体在子宫、卵巢和输卵管中的基因表达量。

4 结论

本试验结果表明，营养性肥胖通过对小鼠生殖器官的影响可降低孕酮膜受体基因的表达，但肥胖对小鼠卵母细胞以及胚胎细胞的影响机制还有待进一步研究。