过氧化氢氧化二硫键对大豆11S蛋白表面活性的影响

李荫展， 李军生， 王靖婷， 李风光， 阎柳娟， 黄国霞

（1．广西科技大学广西糖资源绿色加工重点实验室，广西柳州 545006；2．广西高通食品科技有限责任公司，广西柳州 545100）

大豆蛋白作为一种大宗的植物蛋白，具有潜在的乳化性和起泡性等表面活性性能。经过分离提纯之后的大豆分离蛋白经常被用在食品工业中。大豆分离蛋白是球蛋白，疏水性基团包埋在蛋白质分子内部，从而限制了大豆分离蛋白质的表面活性性能。因此采用绿色的化学方式对大豆分离蛋白进行改性处理，提高其表面活性性能，从而扩大其使用范围是目前的研究焦点。

大豆11S蛋白组分是大豆分离蛋白质中比例最高的成分，比例高达41%，其构成组分基本是单一的11S球蛋白（Zhao等，2011）。研究表明，大豆球蛋白主要是由12个亚基按照A-SS-B基本模式构成的两个环状六角形 （-SS-指二硫键）（Zhang等，2015）。12个亚基分别为6条N末端酸性 ɑ（约 30 kD）亚基（A1、A2、A3、A4、A5、A6）和6条碱性C末端 β （约 20 kD） 亚基（B1、B2、B3、B4、B5、B6），这些亚基之间通过氢键 、二硫键等分子间作用力构成了不同种类的亚基对。大豆11S蛋白组分中半胱氨酸含量为1%左右 （立等，2010），分子内含较多的二硫键，二硫键的存在限制了其表面活性性能展示。李军生等（2012）提出通过控制性打开二硫键方式对大豆分离蛋白进行改性，可改善其乳化性、起泡性等表面活性性能。董振等（2016）通过过氧乙酸对大豆11S蛋白进行氧化改性，研究结果表明氧化处理后大豆11S蛋白的乳化性和乳化稳定性明显提升。Wu等（2009）通过过氧化氢适度氧化大豆分离蛋白，研究结果表明氧化处理能够提高大豆分离蛋白的乳化性以及凝胶性等性能。

故本研究采用不同浓度的过氧化氢氧化处理大豆11S蛋白，揭示氧化体系对大豆11S蛋白性能和结构的影响，研究氧化断开二硫键对大豆11S蛋白结构和性能影响的机理。为氧化制备高表面活性的大豆11S蛋白提供理论依据，为制备蛋白质基表面活性剂提供思路。

1 材料与方法

1.1 材料 大豆11S蛋白组分（自制）；过氧化氢（H2O2），AR，西陇化工股份有限公司；大豆油，嘉里粮油有限公司；十二烷基硫酸钠（SDS），CP，汕头市光华化学厂；还原型谷胱甘肽，BR，国药集团化学试剂有限公司；β-巯基乙醇，99%，北京鼎国生物技术有限责任公司；5,5"-二硫代-2-硝基苯甲酸（DTNB），98%，阿拉丁生化科技股份有限公司。

1.2 大豆11S蛋白的制备 采用Samoto等（2007）的方法稍作修改，脱脂大豆豆粕与水质量体积比1:10混合。用2 mol/L NaOH溶液调pH至8.0，室温搅拌 2 h，4 ℃、5000 g离心 10 min；上清液用 2 mol/L HCl溶液调 pH 至 5.8，4℃、5000 g离心10 min，沉淀加水溶解冷冻干燥即为大豆11S蛋白。

1.3 氧化大豆11S蛋白的制备 采用梯度稀释的方式配制 4 组浓度分别为 0、10、100、1000 mmol/L 过氧化氢溶液 180 mL，编号 1、2、3、4。取冷冻干燥后的大豆11S蛋白7.2 g溶解于上述溶液中，使蛋白质质量浓度约为40 g/L，用2 mol/L HCl溶液调pH至2.0。将溶解后的样品置于4℃冰箱中，反应3 h，用2 mol/L NaOH溶液调pH至8.0，冷冻干燥备用待测。

1.4 十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺（SDS-PAGE）凝胶电泳 参考Hu等（2013）的方法稍作修改，其中分离胶浓度13%，浓缩胶浓度5%。将每个样品分为两组，一组加入添加5%β-巯基乙醇的缓冲液，一组加入未添加β-巯基乙醇的缓冲液，每个样品池上样量15μL，进行电泳分析。电泳条件：先采用90 V电泳30 min，后采用120 V电泳处理2.5 h。电泳结束后采用考马斯亮蓝R-250染色，然后脱色拍照。

1.5 二硫键含量测定 采用Ellman（1959）介绍的方法并稍作修改测定 （分光光度计法）。0.1%DTNB试剂：称取 100 mg DTNB，溶于 100 mL、pH 8.0的磷酸缓冲液中。0.1%NTSB试剂：称取100 mg DTNB，溶于10 mL 1 mol/L的 Na2SO3，再用 pH 8.0磷酸缓冲液定容至100 mL。2 mg/mL谷胱甘肽标准溶液：用pH 8.0的磷酸缓冲液溶解100 mg还原型谷胱甘肽，并定容至50 mL。

标准曲线绘制：取上述配制的谷胱甘肽标准溶液0~6 mL，用pH 8.0的磷酸缓冲液稀释定容至50 mL，各取0.4 mL与0.4 mL DTNB试剂混合后利用蒸馏水定容至10 mL，采用Cary-60紫外可见分光光度计测定待测溶液412 nm处的吸光度。浓度对吸光度值作标准曲线，标准曲线结果如下：

y=0.0234x+0.0001（R2=0.9989）；

式中：x为所测样品的吸光度；y为对应还原型谷胱甘肽浓度；

1.6 乳化性和乳化稳定性测定 采用Luo等（2013）的方法，配制质量浓度10 g/L的蛋白溶液，取20 mL蛋白液与大豆油体积比4:1混合，10000 r/min条件下高速剪切乳化1 min，取0 min和30 min乳化后的样品溶液20μL与 5 mL 0.1%的SDS混合，采用Cary-60紫外可见分光光度计测定待测溶液500 nm处的吸光度值。通过以下公式计算乳化性及乳化稳定性。

式中：T=2.303；N：稀释倍数，250；c：混合前蛋白质质量浓度，g/mL；φ：乳化液中的油相体积分数，0.25；A0：0 min 时的吸光度值；A30：30 min 时的吸光度值。

1.7 起泡性和起泡稳定性测定 配制质量浓度10 g/L的蛋白溶液，取30 mL样品溶液于250 mL烧杯中，利用高速剪切机在10000 r/min条件下均质处理1 min。均质结束后迅速将溶液及泡沫倒入100 mL量筒中，并记下此刻泡沫体积V0。室温静置30 min，并记录30 min时的体积V30。分别利用以下公式计算起泡性和起泡稳定性（Nishinari，2014）。

1.8 表面张力及临界胶束浓度（CMC）测定 参照Bormashenko等（2013）的方法。配制10 g/L的氧化大豆蛋白溶液，分别取 1、3、5、7、9、11 mL 样品溶液利用蒸馏水定容至50 mL（为保证每组样品出现拐点，每组样品测定时配制的浓度组数略有不同）。将蛋白质溶液按照低浓度到高浓度顺序，依次采用全自动界面张力仪测定表面张力，每组样品平行测定三次。采用表面张力对样品浓度作对数图，通过图形拐点坐标得出样品的最低表面张力值和临界胶束浓度CMC值（Sedev,2011）。

1.9 红外光谱测定 参照Yan等（2014）的方法，取冷冻干燥后的氧化大豆11S蛋白10μg与0.1 mg硝酸钾混合压片，采用傅里叶红外光谱仪测定各样品的红外光谱。

1.10 原子力显微镜扫描图测定 参考Song等（2015）的方法，配制浓度为10μg/mL的氧化大豆蛋白溶液，取2μL样品溶液置于新鲜剥离的云母片上，室温干燥测定。测定条件：采用轻巧模式，频率320 kHz；扫描速度1.0 Hz；硅尖长度125μm，曲率半径42 N/m；共振频率290 KHz。

2 结果与讨论

2.1 二硫键的含量变化 过氧化氢等氧化剂可以将蛋白质中二硫键氧化成磺酸基团从而不可逆转的断开蛋白质分子中的二硫键。氧化剂的氧化强度过大时则会将蛋白质分子间和分子内的游离巯基以及二硫键全部生成磺酸基团 （Ye等，2013），并且会造成部分氢键等分子键的破坏，蛋白质的整体结构完全破坏，导致无法测定二硫键变化的情况。从表1可以看出，随着过氧化氢浓度的增加，二硫键的含量呈现降低趋势，当过氧化氢浓度高于10 mmol/L时，过氧化氢直接将游离巯基以及断开的二硫键完全氧化成磺酸基团，从而阻止了二硫键与游离巯基之间的转化，氧化剂浓度越高二硫键断开的越多。表1中磺酸基团的变化规律也说明了当过氧化氢浓度高于10 mmol/L时，二硫键以及游离巯基会在氧化剂作用下氧化生成磺酸基团。

随着过氧化氢浓度的增加大豆11S蛋白中的二硫键打开率迅速增加，且当过氧化氢浓度过高时，二硫键打开率接近100%。表1说明过氧化氢的氧化处理可以使得大豆11S蛋白分子中游离巯基以及二硫键发生不可逆氧化。同时过量的氧化会造成蛋白质分子中二硫键、氢键等分子键最大程度的破坏，导致蛋白质分子结构无规律改变，从而出现无法采用该法测定二硫键的现象。

表1 氧化大豆11S蛋白游离巯基和二硫键的含量

2.2 十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺（SDS-PAGE）凝胶电泳 由SDS-PAGE凝胶电泳图可以看出，未添加β-巯基乙醇时条带大部分出现在分子量66.2 kDa的位置，分子量偏大，而添加β-巯基乙醇时条带出现下调，说明大豆11S的酸性亚基AS与碱性亚基BS通过二硫键相连构成分量较大的亚基聚集体，当经过β-巯基乙醇还原后，二硫键断开，酸性亚基和碱性亚基分开，电泳图出现低分子量条带。通过图1a对比各条带可以发现随着氧化程度的增强，31.0~43.0 kDa以及20.1 kDa附近条带颜色加深，小分子量亚基增加。说明随着氧化程度的增加，二硫键打开的程度增大，大豆11S蛋白中的酸性亚基AS以及碱性亚基BS降解程度增大，形成更多的小分量亚基组分。

图1b是添加β-巯基乙醇的电泳图谱，β-巯基乙醇可以还原蛋白质分子间的二硫键，使得大豆11S蛋白质分子中酸性亚基AS与碱性亚基BS分散，从而通过电泳完整展示蛋白质的亚基构成。通过对比图1b的各条带与Samoto等（2007）结果中的大豆11S组分电泳图发现，本试验所提纯制取的大豆11S蛋白基本满足试验需求。图1b中2~4条带在20.1~31.0 kDa出现许多浅色条带，说明适度的氧化不仅断开蛋白质分子中的二硫键，也造成部分游离巯基与二硫键之间相互转化形成新的亚基组合方式，当添加β-巯基乙醇时各样品中二硫键几乎全部被还原，从而产生许多新的分子量较小的条带。而氧化过度的图1a、1b中的4条带基本没有差别，说明过度氧化使得二硫键不可逆转的断开。

2.3 乳化性及乳化稳定性 由图2可知，过氧化氢的氧化可以改变大豆11S蛋白的乳化性能，且合适的氧化强度可以明显提升大豆11S蛋白的乳化性能。天然的大豆11S蛋白本身具有一定的乳化性能，这也是对其进行改性处理的基础，所以未经处理的1号样品具有一定乳化性和乳化稳定性。随着氧化强度的增强，巯基被氧化成磺酸基团，二硫键被不可逆转的断开，蛋白分子中各亚基之间的作用力减弱，蛋白质高级结构破坏，较多的疏水性基团暴露至分子表面，当蛋白质进行均质乳化时，暴露表面的疏水性残基分散在油水表面，增加蛋白质在此界面上的吸附量，蛋白质分子中疏水残基与油相结合定向排列在油/水界面形成较为致密的吸附膜，同时蛋白质分子结构变得松散，分子柔性增加，从而使蛋白质的乳化性以及乳化稳定性提高 （Ishii等，2016）。但当氧化强度过大时不仅会导致蛋白质分子间的二硫键等不可逆转断开，同时也会使得蛋白质分子间的其他化学键断开，导致蛋白质分解成较小的亚基基团，这些基团在均质乳化过程中，会因为疏水相互作用形成聚集体，导致疏水基团的重新包埋，减少蛋白质分子在油/水界面上的分布，分解成较小的残基之后的蛋白质分子柔性降低，从而导致大豆11S蛋白乳化性和乳化稳定性降低。

2.4 起泡性及起泡稳定性 由图3可知，未经氧化的大豆11S蛋白具有一定的起泡性和泡沫稳定性，但起泡性较弱。经过过氧化氢氧化之后大豆11S蛋白的起泡性能有了不同程度的提升，当过氧化氢浓度达到100 mmol/L时起泡性达到最高值，起泡性能提高了约150%，而随着过氧化氢浓度继续增加起泡性下降。起泡稳定性的变化规律与起泡性略微不同，未经氧化的大豆11S蛋白具有一定泡沫稳定性，且高于低浓度氧化样品的泡沫稳定性，低于较高氧化强度的样品的泡沫稳定性。除此之外，过氧化氢浓度达到1000 mmol/L时泡沫稳定性明显增高。

随着氧化程度的增强，蛋白质中二硫键与游离巯基发生转移，二硫键发生不可逆转断开，在此过程中蛋白质发生去折叠、重组装等变化，导致蛋白质分子中疏水基团之间的相互作用增强，从而提高起泡性（Vatanparast等，2017）。当氧化程度增加，二硫键被大部分断开后蛋白质分子内部的疏水基团暴露，蛋白质在溶液状态时亲水基团与疏水基团比例接近平衡，蛋白质分子在溶液表面的定向排列更加有序，大豆11S蛋白的起泡性能明显提高。氧化强度过强时蛋白质分子降解为各种小分子量亚基组分，从而增大了蛋白质在溶液中分子数目，较小的亚基也较易在水中定向排列，从而泡沫稳定性增加，但由于亚基在水溶液状态会受到疏水相互作用从而使得部分疏水基团包埋，所以过度氧化，起泡性下降。从图2整体来看氧化能明显提高大豆11S蛋白的起泡性但对大豆11S蛋白的泡沫稳定性影响不大。

2.5 表面张力（γCMC）及 CMC值 表面活性剂水溶液的表面张力会随着浓度的升高而下降，且会在较低浓度范围内急剧下降，随着浓度的不断增加，表面活性剂在水溶液中会逐渐形成稳定的胶束或胶团，一定胶束形成后的溶液其表面张力基本保持稳定，不会随浓度的增加而改变。表面活性剂溶液胶束大量形成对应的浓度即为溶液的临界胶束浓度（CMC）（Wang等，2013）。因此可以采用表面张力对浓度作对数图，图形上出现的拐点所对应的浓度即为表面活性剂的CMC值（Kuperkar，2016）。

从图4可以看出，各组样品的表面张力-浓度对数图均出现类似拐点，但拐点出现的趋势以及所对应的坐标不同。随着氧化程度的增加拐点趋势逐渐明显，但氧化程度过高时拐点趋势略微平缓，所以氧化处理后的大豆11S蛋白都具有一定的表面活性剂特征，而未经氧化的大豆11S蛋白特征不明显。根据图4可得各组样品的γCMC和CMC值（表2）。由表2可知，经过氧化处理之后大豆11S蛋白的γCMC均降低，且拐点所对应的样品浓度（CMC）也随氧化程度的增加而减小，说明氧化改性可以降低大豆11S蛋白的界面张力，提升其在溶液空气界面形成胶束的能力，从而提高其表面活性性能。这一结果主要因为氧化改性处理时氧化断开了蛋白质分子中的二硫键等分子键，蛋白质高级结构被打开，结构变的松散，柔性增强，分子中亲水基团和疏水基团从新分布排列，从而使蛋白质展示更明显的表面活性剂特征。当然合适的氧化更有利于提升大豆11S蛋白的表面活性性能，过度氧化会使蛋白质分子亚基在水溶液中会受到疏水相互作用而再次折叠，从而使得表面活性性能降低。

表2 各组样品的γCMC和CMC值

2.6 红外光谱测定 由图5可知，高波段样品在3266 cm-1的吸收峰经过氧化向低波段移动，该波段主要涉及蛋白质分子内的氢键，通过峰位的蓝移和峰强的变化可以看出经过氧化之后蛋白质分子中的氢键增加，其有利于蛋白质重新折叠，从而增强内部疏水基团与外界物质的相互作用，提高蛋白质的表面活性（Guo等，2015）。样品在1664 cm-1的吸收峰经过氧化之后蓝移至1646 cm-1，该波段蓝移对应的是蛋白质二级结构的β-转角、α-螺旋向无规卷曲的转变（Tang等，2009）。说明经过氧化之后由于二硫键等分子间的断裂，以及新的氢键形成导致蛋白质的高级有序结构发生改变，蛋白质的无序结构增加，分子的柔性增加，从而提高了蛋白质的表面活性性能。样品1540 cm-1处的吸收峰归属于酰胺Ⅱ带氧化之后蓝移至1537 cm-1，结合图中的峰型可以看出，蛋白质内的氢键增多，重新折叠内部疏水基团暴露在蛋白质表面，氢键重新稳定蛋白质的高级结构。1238 cm-1处的吸收峰归属于β-折叠经过氧化之后蓝移至1230 cm-1处，结合图中各组样品的峰强可以看出经过氧化之后β-折叠增加。β-折叠这种片层结构需要氢键等作用力将两条以上的肽链连接起来，在形成这种结构的过程中氢键的含量会增加，并且蛋白质分子中的垂直结构会增加，从而减少维持蛋白质高级结构所需要的能量，其次片层状的平行或反平行结构可以减少侧链基团的阻碍作用，使得蛋白质结构呈现伸展状态，从而增加蛋白质的表面活性性能。1068 cm-1和620 cm-1处的吸收峰位是磺酸基团的归属峰，通过图中各组样品的峰型可以看出经过氧化处理之后磺酸基团增加。

综上所述，大豆11S蛋白经过氧化之后无规卷曲和β-折叠片层增多，蛋白质在氢键作用下重新折叠形成结构伸展柔性更强的蛋白质分子，从而增加了表面活性性能。除此之外磺酸基团的增加也证实了经过氧化之后大豆11S蛋白质分子中的二硫键发生了不可逆断开，这一结果表明蛋白质分子内部疏水性基团不可逆转地暴露至分子表面，大豆11S蛋白的表面活性性能提升。

2.7 原子力显微镜扫描结果 采用原子力显微镜（AFM）对各样品的微观结构进行研究，可以直观地看出经过氧化处理之后各组样品的形貌变化。从而推断氧化作用对大豆11S蛋白形貌的影响，进而推断对其结构和表面活性的影响。

大豆11S蛋白经过不同浓度的过氧化氢处理后的原子力显微镜扫描结果显示，扫描范围分别为10.00μm×10.00μm，未经处理的大豆11S蛋白质颗粒大小不均一，颗粒较大，约为1000~2000 nm；过氧化氢浓度为10 mmol/L时，蛋白质分子间作用力破坏，分子解聚，大颗粒蛋白减少，均匀度增加，约为500~800 nm；过氧化氢浓度为100 mmol/L时与未处理样品对比发现，颗粒均一性增强，适度氧化使蛋白质分子高级结构改变，而亚基结构未发生较大改变，从而使得蛋白质颗粒变小，均一度增加，颗粒约为50~100 nm；过氧化氢浓度为1000 mmol/L时出现较大颗粒蛋白，且颗粒不均匀度增加，说明过度的氧化完全破坏了蛋白质的结构，导致蛋白质分子降解为小分量的亚基组分，颗粒约为800~1500 nm，在脱水自然干燥时，不均一的小颗粒重新发生聚集形成较大的聚集颗粒（Mcclements，2007）。由此可知经适当氧化断开部分二硫键可使蛋白质分子适度解聚，形成均一度较好的小颗粒蛋白，进而提高蛋白质在溶液状态的表面活性性能。

3 结论

本试验结果表明，低浓度的过氧化氢会诱导游离巯基与二硫键的转化从而导致蛋白质分子的重新折叠形成集聚体，再次包埋暴露的疏水性残基；随着氧化程度的增加，二硫键被不可逆转地断开生成磺酸基团，从而使得蛋白质分子不可逆转的解聚，疏水性残基暴露，蛋白质表面活性性能增加；而过量氧化会导致蛋白质分子分解成小分量亚基，这些亚基由于疏水相互作用发生聚集形成不溶性大颗粒蛋白，从而导致蛋白质分子的表面活性性能降低。

通过测定各组样品的表面活性性能如乳化性能、起泡性能的结果可以得出，经过浓度100 mmol/L的过氧化氢处理的大豆11S蛋白表面活性最好，HLB值、γCMC和CMC值也表明该浓度过氧化氢氧化处理之后的大豆11S蛋白具有更好的表面活性剂的类似性能。原子力扫描电镜图表明经过氧化大豆11S蛋白质发生了解聚，分子颗粒变小，颗粒均匀度增加，同时可溶性蛋白颗粒的含量增加。通过以上分析可以得出，浓度100 mmol/L的过氧化氢能够较好的改善大豆11S蛋白的表面活性性能。