砷暴露的体外及体内微核试验研究

郑艳艳，谢晶，甘永金，梁丹玉，李羡筠

广西壮族自治区职业病防治研究院中毒与毒理研究所，广西 南宁 530021

20世纪90年代开始，用微核技术检测化学致癌物对细胞的遗传损伤研究得到了发展[1-2]。已有大量数据表明，砷可导致肿瘤的发生[3-5]。为了进一步了解砷的遗传损伤作用，本研究采用体外胞质分裂阻滞法微核试验及体内外周血嗜多染红细胞微核试验观察不同剂量砷暴露引起的微核率改变。

1 材料与方法

1.1 体外实验

1.1.1 材料 正常人肝素钠抗凝外周血；RPMI1640培养基(中国协和医科大学基础医学院提供)；亚砷酸钠(NaAsO2，广州化学试剂厂)；细胞松弛素B(CytoB，Sigma)；甲醇、冰醋酸为国产分析纯。

1.1.2 试验方法 在4.5 mL RPMI1640培养基中取加入正常人抗凝血0.4 mL及0.1 mL不同浓度的NaAsO2溶液(砷终浓度为0 μg/L、50 μg/L、100 μg/L、200 μg/L、400 μg/L)，置37℃培养至72 h 收获细胞(44 h 时加入终浓度为6 μg/mL 细胞松弛素B)，用常规方法制片，Giemsa染色后封片保存。在油镜下计数结构完整、着色清晰的双核淋巴细胞微核数。

1.2 体内实验

1.2.1 材料 实验动物为体质量25～30 g 的无特定病原体动物(SPF)级ICR 雄性小鼠40 只，由湖南斯莱克景达实验动物有限公司提供[许可证号：SCXK(湘)2016-0002]。本实验室取得广西壮族自治区科技厅颁发的《实验动物使用许可证》，许可证号：SYXK桂2016-0005。

1.2.2 试验方法 将ICR 雄性小鼠40 只应用完全随机化的方法分为阴性对照组、10 mg/(kg·bw)组、20 mg/(kg·bw)组、30 mg/(kg·bw)组，每组10 只，亚砷酸钠按剂量要求经口灌胃染毒，隔天染毒1次，共染毒3次，阴性对照组给予生理盐水。末次染毒后第3天从动物尾静脉采集外周血用血涂片法直接涂片，空气干燥后放入甲醇固定10 min，Giemsa染色后在油镜下观察嗜多染红细胞的微核。

1.3 统计学方法 利用SPSS13.0 统计软件进行统计学处理，计数资料进行χ2检验，以P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 不同浓度NaAsO2对体外淋巴细胞微核的影响 由表1 可见，体外胞质分裂阻滞法微核试验中双核淋巴细胞在砷终浓度为200 μg/L、400 μg/L 时的微核率高于0 μg/L，差异均有统计学意义(χ2=125.856，P＜0.05)。双核淋巴细胞的微核率随含砷浓度增加，微核率呈线性增多。图1 为含有1 个微核的双核淋巴细胞。

表1 不同浓度NaAsO2的体外淋巴细胞微核试验结果

图1 含微核的双核淋巴细胞(×100)

2.2 不同浓度NaAsO2对体内微核的影响 体内试验经口给予亚砷酸钠后，20 mg/(kg·bw)、30 mg/(kg·bw)剂量组受试动物出现活动减少、嗜睡等中毒症状，出现个别动物死亡。由表2可见，体内微核试验外周血嗜多染红细胞微核率30 mg/(kg·bw)剂量组明显高于阴性对照组，差异有统计学意义(χ2=13.930，P＜0.05)，并呈剂量-反应关系。图2为油镜下观察的外周血嗜多染红细胞，箭头所指的是含有微核的嗜多染红细胞。

表2 不同浓度NaAsO2的体内微核试验结果

图2 油镜下外周血嗜多染红细胞(箭头所指为有微核的嗜多染红细胞，×100)

3 讨论

微核是由具有遗传损伤的物质作用于细胞后导致染色体断裂或整条染色体丢失形成的。微核试验是国际上公认用于筛选遗传损伤物质的毒理学试验，可分为体内试验和体外试验。

体外淋巴细胞微核试验是将受试物暴露于淋巴细胞，37℃培养，加入植物血凝素促其分裂增殖，利用细胞松弛素B 抑制细胞胞质分裂但不影响细胞核分裂，再观察双核淋巴细胞微核率，反映出受试物在染色体水平上所受到的遗传损伤。体内微核试验是通过适当染毒方法给予受试物后，观察动物外周血嗜多染红细胞微核发生率，以评价受试物发生突变的可能性。在红细胞系祖细胞分裂期如有遗传损伤的物质作用会导致中期染色体分裂异常形成微核，有核红细胞发生脱核形成无核的红细胞过程中胞浆中的微核并不能通过脱核排出，残留于红细胞细胞质中，形成携带微核的嗜多染红细胞[6]。由于嗜多染红细胞胞质内含有核糖体，成熟红细胞核糖体已消失，可通过选择性的染色即Giemsa 染色将嗜多染红细胞染成灰蓝色，而成熟红细胞染成淡橘红色，通过显微镜下观察细胞颜色的不同将两种细胞区别开来。

随着经济的不断发展，砷化物的开采、冶炼等不断增加，砷虽是个古老的毒物，但砷对人类健康造成的危害不容忽视。砷可阻止细胞呼吸，导致细胞代谢发生障碍，对多种酶有抑制作用，流行病学资料显示，砷暴露人群可导致DNA 损伤等明显的细胞遗传毒性[7-11]。长期暴露砷可导致自然流产、试产、早产发生率及低出生体重危险度显著升高，长期吸入高浓度大于100 ng/m3砷死产OR 值高达8.4[12]。国际癌症研究机构将无机砷确认为人类致癌物，但砷致癌流行病研究和动物试验结果并不完全相同。为减少人群混杂因素的影响，本研究在实验室单一条件下分别进行体内和体外微核试验，体外试验用胞质分裂阻滞法微核试验研究砷暴露引起的淋巴细胞遗传损伤，试验结果表明砷终浓度为200 μg/L、400 μg/L 的条件下，淋巴细胞双核微核率明显增加。在试验过程中发现高浓度砷暴露可导致淋巴细胞转化率下降，细胞死亡现象明显，双核淋巴细胞容易观察到多个微核出现，且容易观察到核质桥和核芽，核质桥和核芽是近期发现的早期染色体损伤的生物学标志，核质桥是基因错误修复的标志，而核芽是基因扩增的标志[13]。试验中高浓度砷暴露出现的核质桥和核芽的改变将成为下一步研究的重点。体外微核试验的优点是直接或间接诱导DNA损伤，判断有无诱发染色体异常的毒理效应，但体外试验是一种非正常生理条件下的实验，因此在实验设计时增加了体内微核试验。体内微核试验以ICR 雄性小鼠为研究对象，实验动物经口灌胃给予亚砷酸钠后，通过观察动物外周血嗜多染红细胞微核率的发生情况，判断砷暴露引起的遗传损伤，体内试验结果表明，嗜多染红细胞微核随着染毒剂量的增加而增加，呈剂量-反应关系。本次通过体内体外两种方式分别研究砷暴露的遗传损伤，其结果均提示砷可导致遗传损伤。