miR-185通过靶向调控TAZ基因抑制非小细胞肺癌H1299细胞增殖、迁移和侵袭

徐萌博 赵天增 杨金华 (南阳医学高等专科学校第一附属医院普胸外科，河南 南阳 473058)

肺癌发病率和死亡率在恶性肿瘤中均高居首位〔1，2〕，5年生存率低于15%，而且<40岁的低龄肺癌患者也逐渐呈上升趋势，且预后较高龄患者差〔3,4〕。

分子靶向药物可有效地改善非小细胞肺癌(NSCLC)患者预后〔5〕。研究证实，微小RNA(miRNA)在肺癌组织和细胞中作为肿瘤抑制或促进因子，参与癌细胞的增殖、侵袭、迁移和凋亡等过程〔6〕。miR-185在肺癌细胞中表达下调，与多个基因作用，参与调控肿瘤细胞的增殖和迁移等生物学过程〔7～9〕。转录共激活因子(TAZ)是Hippo通路的下游效应分子，Hippo通路最早发现于果蝇中，是一种阻碍细胞生长的抑制性信号通路，主要调控细胞增殖、器官大小等〔10〕。TAZ在NSCLC组织中呈现高表达，且其表达与患者预后密切相关〔11,12〕。miR-185和TAZ在肺癌增殖、迁移和侵袭中都具有重要作用，而两者在肺癌中是否存在某种调控关系，尚不清楚。本研究以NSCLC 细胞H1299为研究对象，研究 miR-185影响H1299细胞增殖、侵袭和迁移的分子机制及TAZ在此机制中的作用。

1 材料与方法

1.1材料 人肺癌细胞株H1299和人正常肺黏膜上皮细胞株BEAS-2B购自ATCC；胎牛血清(FBS)和DMEM培养基购自Gibco公司，牛血清白蛋白(BSA)、噻唑蓝(MTT)、二甲基亚砜(DMSO)和胰蛋白酶Trypsin购自Sigma-Aldrich公司；Transwell板购自美国Corning公司；双荧光素酶报告系统(Dual-Luciferase Reporter Assay System)购自美国Promega公司；Lipofectamine2000转染试剂、Total RNA提取试剂盒、 RT聚合酶链反应(PCR)试剂盒、反转录试剂盒购自美国Invitrogen公司；抗TAZ抗体和β-actin抗体购自Abcam；光学显微镜、全自动酶标仪及RT-PCR仪购自美国Bio-Rad公司；二喹啉甲酸(BCA)蛋白检测试剂盒购自Thermo。

1.2细胞培养 用含10% FBS+100 U/ml 青霉素+100 μg/ml链霉素的DMEM培养基培养H1299细胞，37℃ 5%CO2培养箱中培养，湿度95%。待细胞生长至对数生长期时洗涤消化传代。

1.3细胞转染 培养H1299细胞至对数生长期，用细胞培养液稀释细胞浓度至1×106个/ml，200 μl/孔接种于6孔板中，细胞培养至基本融合为一层时按照Lipofectamine2000说明书进行转染。先用无血清OptiMEM培养液稀释Lipofectamine2000、si-con、si-TAZ、miR-con、miR-185、miR-185+pcDNA、miR-185+pcDNA-TAZ、anti-miR-con、anti-miR-185、野生型(WT)-TAZ+miR-con、WT-TAZ+miR-185、突变型(MUT)-TAZ+miR-con和MUT-TAZ+miR-185的载体，之后取等体积Lipofectamine2000和各组载体混合，轻柔混匀后室温孵育20 min，将混合液滴入到培养好的细胞孔板中，边滴加边轻晃培养板，混匀后置37℃ 5% CO2培养箱中培养，6 h后换成完全培养基，转染48 h后收集细胞进行后续实验。

1.4RT-PCR检测mRNA的表达 收集转染后培养48 h的各组H1299细胞(miR-con组、miR-185组、anti-miR-con组、anti-miR-185组、si-con组和si-TAZ组)，用试剂盒提取总RNA，测定浓度和纯度，保存于-80℃。然后按照反转录PCR试剂盒说明书合成cDNA，反应程序为16℃ 40 min、42℃ 40 min、72℃ 10 min；4℃放置10 min，合成的cDNA测定浓度和纯度后置于-80℃保存。取cDNA按照RT-PCR的说明书进行反应，反应程序为：95℃ 5 min；95℃ 40 s、58℃ 45 s、72℃ 40 s，42个循环；72℃ 10 min。引 物 如 下：miR-185 上 游： 5′-GTGCAGGGTCCGAGGT-3′，下游： 5′-TGGAGAGAAAGGCAGTTCCTGA-3′；TAZ上游：5′-TGAGAGCCGAAGCCCTTAGA-3′，下游： 5′-GGATTCATCTTCTGGGCGGG-3′。运用IQ5TM RT-PCR Detection System(Bio-Rad)进行数据分析。

1.5MTT实验测定细胞活性 收集转染后的H1299细胞，Trypsin消化细胞后，用培养液调整细胞浓度至1×104个/ml，2×103个/孔(200 μl/孔)接种于96微孔板中，继续培养，分别在24、48、72 h进行 MTT 实验，每孔加入 20 μl(5 mg/ml)MTT，继续培养4 h，弃上清培养液，每孔加入150 μl DMSO，室温振荡5 min，酶标仪测定OD490 nm 处的吸光度(A)值。

1.6Transwell实验测定细胞迁移和侵袭 迁移实验：转染后的各组H1299细胞(miR-con组、miR-185组、si-con组、si-TAZ组、miR-185+pcDNA组和miR-185+pcDNA-TAZ组)培养至对数生长期，收集细胞加入含1%FBS的DMEM培养基，培养12～24 h，用Trypsin消化细胞，离心收集细胞，磷酸盐缓冲液(PBS)洗涤2次，加入含10 g/L BSA的DMEM培养基，调整细胞浓度为2×105个/ml。Transwell下层培养孔加入500 μl 10%FBS培养基作为迁移趋化物，取100 μl细胞加入Transwell上层小室，再将上层小室放入下层培养孔中，培养48 h，取出用棉签拭去基质胶和上层小室的细胞，冰甲醛固定细胞，结晶紫染色，显微镜观察计数。

侵袭实验：从-20℃将基质胶取出，置于4℃冰箱融化过夜，以4℃无血清培养基1∶3比例稀释基质胶，加入上层Transwell小室，37℃ 3 h烘干，以下步骤同迁移实验，上层小室加入100 μl细胞，下层加入500 μl 10%FBS培养基，培养48 h，冰甲醛固定细胞，结晶紫染色，计数。

1.7双荧光素酶报告实验 将转染48 h后的H1299细胞进行胰蛋白酶消化，计数，以1×104个细胞/孔接种于24孔板中，CO2培养箱中继续培养24 h，观察若细胞融合度达到80%～90%，则按照Lipofectamine2000说明书进行转染，分别构建WT-TAZ和MUT-TAZ双荧光素酶报告载体，分别共转染miR-con或miR-185，转染后培养48 h，收集细胞，加入配制好的裂解缓冲液，室温裂解15 min，离心收集上清，-20℃保存或直接检测。加入荧光素酶底物，发光仪检测荧光素酶活性。以海肾荧光素酶活性为内参照，计算相对萤火虫荧光素酶活性。

1.8Western印迹实验 将BEAS-2B细胞和转染后的各组H1299细胞(miR-con组、miR-185组、anti-miR-con和anti-miR-185组)继续培养48 h，然后收集细胞，加入放射免疫沉淀法(RIPA)裂解液重悬细胞，冰浴超声破碎细胞，收集蛋白并检测蛋白浓度。每个样本取30 μg蛋白进行十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)，转膜，5%脱脂奶粉室温封闭1 h，加入1 000倍稀释的一抗TAZ，4℃孵育过夜。TBST缓冲液洗膜2次，然后加入500倍稀释的二抗，室温孵育2 h。以β-actin为内参照，分析蛋白水平。

1.9统计学方法 采用SPSS21.0软件进行t检验、方差分析。

2 结 果

2.1miR-185和TAZ在肺癌H1299细胞和人正常肺上皮细胞BEAS-2B中的表达 与BEAS-2B组相比，在肺癌细胞H1299组中TAZ的表达量显著升高(P<0.01)，而miR-185的表达量则显著下降(P<0.001)，见图1，表1。

图1 检测TAZ在肺癌H1299细胞和人正常肺上皮细胞BEAS-2B中的表达

2.2过表达miR-185可抑制肺癌H1299细胞增殖、迁移和侵袭 与miR-con组相比，miR-185组的miR-185表达水平显著上升(P<0.001)，miR-185组的细胞活性(OD490 nm)在48 h、72 h均显著下降(P<0.05，P<0.01)，miR-185组迁移细胞数和侵袭细胞数均显著下降(P<0.001，P<0.01)，见表2。

表1 检测miR-185和TAZ在H1299和BEAS-2B中的表达

组别miR-185细胞活性(OD490 nm)24 h48 h72 h迁移细胞数(个)侵袭细胞数(个)miR-con组0.25±0.040.29±0.040.55±0.070.86±0.09173.50±12.13107.65±12.84miR-185组1.24±0.110.26±0.030.38±0.050.55±0.0665.18±7.4540.58±5.88t/P值14.650/0.0001.039/0.3573.423/0.0274.964/0.00813.180/0.0008.226/0.001

2.3miR-185靶向调控TAZ的表达 TAZ的3′-UTR序列中含有与miR-185互补的核苷酸序列，见图2A。与miR-con组相比(0.79±0.09)，miR-185组的TAZ蛋白表达水平均显著下降(0.19±0.05，P<0.05)；与anti-miR-con组相比(0.74±0.08)，anti-miR-185组的TAZ蛋白表达量均显著上升(1.55±0.12，P<0.05)，见图2B。与miR-con组相比，miR-185组WT-TAZ的萤火虫荧光素酶相对活性显著下降(P<0.001)；而MUT-TAZ的萤火虫荧光素酶相对活性没有明显变化。见表3。

图2 miR-185靶向抑制TAZ 的表达

表3 双荧光素酶报告实验

2.4沉默TAZ抑制肺癌H1299细胞增殖、迁移和侵袭 与si-con组相比，si-TAZ组TAZ表达水平显著下降(P<0.001)，si-TAZ组H1299细胞活性在48、72 h时均显著降低(P<0.01)，迁移细胞数和侵袭细胞数也显著下降(P<0.01)，见图3，表4。

图3 肺癌H1299细胞中TAZ的表达

组别TAZ蛋白细胞活性(OD490 nm)24 h48 h72 h迁移细胞数(个)侵袭细胞数(个)si-con组0.78±0.070.32±0.040.58±0.060.84±0.09168.12±12.42102.70±11.05si-TAZ组0.28±0.040.27±0.030.35±0.040.52±0.0669.44±6.2441.40±5.48t/P值10.742/0.0001.732/0.1585.524/0.0055.124/0.00712.297/0.0008.608/0.001

2.5过表达miR-185和过表达TAZ对H1299细胞增殖、迁移和侵袭的影响 与miR-con组相比，miR-185组48 h和72 h时H1299细胞活性、迁移和侵袭细胞数均显著下降(P<0.05)；与miR-185+pcDNA组相比，miR-185+pcDNA-TAZ组H1299细胞活性、迁移和侵袭细胞数均显著上升(P<0.05)。见表5。

组别细胞活性(OD490 nm)24 h48 h72 h迁移细胞数(个)侵袭细胞数(个)miR-con组0.30±0.040.61±0.070.88±0.09147.56±14.78106.64±11.28miR-185组0.26±0.030.38±0.051)0.59±0.061)67.44±7.241)45.78±5.661)miR-185+pcDNA组0.25±0.030.36±0.040.55±0.0660.12±7.1639.70±4.92miR-185+pcDNA-TAZ组0.29±0.040.53±0.052)0.72±0.072)107.82±12.342)81.40±9.382)F/P值1.360/0.32315.096/0.00113.168/0.00241.322/0.00043.713/0.000

与miR-con组比较：1)P<0.05；与miR-185+pcDNA组比较：2)P<0.05

3 讨 论

miR-185首次发现于人神经母细胞瘤〔13〕，在肺癌、肝癌、乳腺癌等多种肿瘤组织和细胞中均异常表达，可通过靶向肿瘤相关基因参与肿瘤细胞增殖、迁移、侵袭和凋亡等过程〔14〕。miR-185在NSCLC组织和细胞系中表达显著下调〔15〕，在肺腺癌细胞系也显著下调〔9,16〕，且与肿瘤大小、分期和低总存活率相关〔15〕。曹燕飞等〔7〕研究发现，miR-185在肺癌细胞中表达呈现显著下调，其通过抑制E2F6表达而抑制肺鳞癌细胞的增殖和侵袭，过表达miR-185可以靶向下调Six1基因表达调控上皮-间质转化(EMT)途径从而抑制肺癌细胞的迁移和侵袭能力〔8〕。本研究结果表明，过表达miR-185则可抑制H1299细胞增殖、迁移和侵袭。

TAZ基因作为Hippo通路的主要成员，具有调控哺乳动物器官大小的作用〔17〕。研究表明，TAZ在肺癌组织中出现表达上调，与肺癌细胞的侵袭和迁移有关〔10,11,18〕。本研究证实，沉默TAZ基因表达则可抑制肺癌H1299细胞增殖、迁移和侵袭。此外，本研究通过Targetscan软件预测发现，TAZ的3′-UTR序列中含有与miR-185互补的核苷酸序列，暗示miR-185与TAZ之间可能存在某结合位点或者某种调控关系。Western印迹和双荧光素酶报告结果均表明，miR-185反向调控TAZ的表达，而外源回补TAZ表达则会逆转过表达miR-185对H1299细胞增殖、迁移和侵袭的抑制作用。两者的关系在胰腺癌中也被研究，Xia等〔19〕发现，在胰腺癌患者样本(包括癌组织、胰液和血清)中，TAZ表达水平上调，miR-185和TAZ的表达呈负相关，沉默TAZ和过表达miR-185均可抑制胰腺癌组织的增殖，miR-185通过靶向TAZ调控胰腺癌组织的增殖。而本研究结果与Xia等〔19〕研究结果类似，在NSCLC中，过表达miR-185和沉默TAZ基因均可抑制H1299细胞增殖、迁移和侵袭，miR-185通过靶向TAZ调控肺癌组织的增殖、迁移和侵袭。miR-185有望成为肺癌诊断和治疗新的靶标，对肺癌的诊断和治疗具有重要的指导意义。