芪黄疽愈方调节ASO大鼠炎症细胞因子

孙云朝 郭娜 李德辉 葛建立 马云龙 张欣 苏坤 (河北省中医院，河北 石家庄 050000)

肢体动脉硬化闭塞症(ASO)是外科临床常见病，发病率随年龄增长而逐渐升高，患者早期出现间歇性跛行等下肢缺血的临床表现，病情进一步发展可出现下肢营养障碍，表现为静息痛，直至肢端发生坏死而截肢，降低了患者生活质量。目前ASO治疗有药物治疗、血管介入、手术治疗等，但外科手术移植物长期通畅率低，血管介入远期疗效并不肯定，尚缺乏确切理想的治疗方法。中医治疗从病因病机到诊断治疗均有记载，虽疗效尚可，但多不稳定，每易复发，且大多仅为临床经验的总结，尚缺乏系统的科学论证。课题组前期对ASO做了大量临床研究，应用芪黄疽愈方治疗ASO取得满意疗效，并且成功制作了大鼠模型，从实验角度再次证实芪黄疽愈方的治疗作用〔1～3〕，但其生物学机制仍待进一步明确。芪黄疽愈方治疗ASO可能与调节炎症反应相关细胞因子有关。本研究旨在探讨芪黄疽愈方对ASO大鼠炎症细胞因子的影响。

1 材料与方法

1.1实验动物 清洁级雄性SD大鼠50只(4～6周龄)，体重(200±20)g，由河北医科大学实验动物中心提供。

1.2饲料制备〔4〕高脂饲料，配比为83.5%基础饲料，5%猪油，1%胆固醇，0.5%胆酸钠及10%蛋黄粉。

1.3药物及试剂 芪黄疽愈方：黄芪20 g、黄精12 g、红花12 g、鬼箭羽12 g、土鳖虫9 g、鸡血藤15 g、延胡索12 g、牛膝9 g、海藻12 g，由河北省中医院煎药室煎制，配制成最终浓度分别为0.35 g/ml，0.75 g/ml，1.5 g/ml药液。实验过程中每次中药制剂均按同一标准进行；维生素D3注射液(江苏吴中苏州制药)；大鼠内皮素(ET)-1、白细胞介素(IL)-1β试剂盒(欣博盛生物科技有限公司)；一氧化氮(NO)试剂盒(武汉华美生物工程有限公司)；核因子(NF)-κB p65抗体、肿瘤坏死因子(TNF)-α抗体均购自Abcam公司。

1.4实验分组与造模 50只雄性SD大鼠随机分为正常对照组、疾病模型组、芪黄疽愈方高浓度组、芪黄疽愈方中浓度组、芪黄疽愈方低浓度组，每组10只，正常对照组普通饮食喂养，自由饮水。疾病模型组与芪黄疽愈方各剂量组高脂饲料喂养1 w，于清洁动物实验室内用1%戊苯巴比妥钠(1 ml/200 g)腹腔注射麻醉；每只大鼠取左后肢消毒，从腹股沟中点向后肢内侧纵行切开皮肤，分离并暴露隐动脉，用动脉夹阻断隐动脉远近端1.5～2.0 cm，取胰岛素注射器1支，沿隐动脉血管长轴由远端向近端刺入血管腔，将0.2～0.3 ml注射用无菌蒸馏水缓慢注入阻断部位血管，至血管充盈为止，5 min后取下针头和动脉夹，压迫止血，缝合切口，内膜损伤模型完成〔4〕。后疾病模型组大鼠予以高脂饲料喂养，并在大鼠右下肢肌肉注射维生素D3针剂(3×105U/kg体重)，每隔30 d重复1次；造模1 w后，给予生理盐水(1 ml/100 g)灌胃，每日1次，连续12 w，自由饮水。芪黄疽愈方各剂量组(高浓度组、中浓度组、低浓度组)大鼠予以高脂饲料喂养，并在大鼠右下肢肌肉注射维生素D3针剂(3×105U/kg体重)，每隔30 d重复1次；造模1 w后，芪黄疽愈方相应浓度中药灌胃(1 ml/100 g)，每日1次，连续12 w，自由饮水。

1.5检测指标

1.5.1血清ET-1、NO、IL-1β含量检测 末次给药前禁食12 h，给药1 h后，用1%戊苯巴比妥钠(1 ml/200 g)腹腔注射麻醉，下腔静脉采血约8 ml，2 500 r/min离心5 min后，分离出血清，用于ET-1、NO、IL-1β检测。检测方法按试剂盒说明书。

1.5.2动脉内皮TNF-α、NF-κB蛋白表达水平检测 切取大鼠左后肢隐动脉放入1.5 ml的EP管中，加裂解液匀浆，离心后吸取上清，4℃保存备用；配制牛血清白蛋白(BSA)浓度梯度标准液及二喹啉甲酸(BCA)工作液，进行蛋白质定量分析；将提取的蛋白电泳、转膜后，一抗与靶蛋白结合，辣根过氧化物酶标记的二抗与一抗结合；将聚偏氟乙烯(PVDF)膜平铺于保鲜膜上，加入电化学发光(ECL)液避光反应2 min。采用Quantity One成像系统对PVDF膜进行灰度扫描，运用Image Lab分析软件对各组条带进行分析。

1.6统计分析 采用SPSS20.0软件进行单因素方差分析、t检验。

2 结 果

2.1血清ET-1、NO、IL-1β含量水平变化 与正常对照组比较，疾病模型组血清ET-1、IL-1β含量水平显著升高，NO水平显著降低(均P<0.01)。与疾病模型组比较，芪黄疽愈方各剂量组血清ET-1、IL-1β含量水平均显著下降，NO水平显著升高(均P<0.01，P<0.05)，见表1。

2.2动脉内皮TNF-α、NF-κB蛋白表达水平检测 与正常对照组比较，疾病模型组动脉内皮TNF-α、NF-κB蛋白表达水平明显升高(均P<0.01)；与疾病模型组比较，芪黄疽愈方各剂量组动脉内皮TNF-α、NF-κB蛋白表达水平均显著下降(P<0.01，P<0.05)。见图1及表2。

表1 各组血清ET-1、IL-1β含量

与空白对照组比较:1)P<0.01；与疾病模型组比较:2)P<0.05，3)P<0.01；下表同

1:正常对照组;2:疾病模型组;3:芪黄疽愈方低浓度组;4:芪黄疽愈方中浓度组;5:芪黄疽愈方高浓度组图1 各组TNF-α、NF-κB蛋白表达

组别TNF-α/β-actinNF-κB/β-actin正常对照组0.53±0.180.65±0.17疾病模型组0.94±0.321) 0.97±0.281)芪黄疽愈方低浓度组0.86±0.302) 0.68±0.212)芪黄疽愈方中浓度组0.77±0.242) 0.59±0.153)芪黄疽愈方高浓度组 0.55±0.213) 0.52±0.133)

3 讨 论

ASO是指由于动脉粥样硬化导致下肢供血动脉内膜增厚、管腔狭窄或闭塞，病变肢体血流供应不足，从而使肢体出现一系列缺血症状的慢性进展性疾病，其临床表现包括下肢间歇性跛行、皮温降低、疼痛，乃至发生溃疡或坏死等〔5〕。ASO的发病机制尚不明确，主要有脂质渗透、内膜损伤、血栓形成和平滑肌反应学说，但大多数学者认为内膜损伤对ASO的形成作用更为突出〔6〕。当血管内皮结构受到损伤时，会出现血管内皮细胞(VEC)内分泌功能的障碍，VEC分泌的活性物质平衡破坏。病理情况下VEC损伤表现为ET-1合成和释放增加，具有强烈的缩血管和促细胞增殖作用；而内皮保护因子NO分泌水平降低，从而使血管平滑肌处于持续收缩状态。IL-1又名淋巴细胞刺激因子，主要由活化的单核-巨噬细胞产生，是机体炎症反应的重要介质。IL-1能够诱发血管内皮细胞活化并分泌IL-1β，使其表达血管细胞黏附分子(VCAM)-1，介导免疫细胞和脂质浸润血管壁形成斑块，在动脉硬化闭塞症形成过程中发挥重要作用。TNF-α被认为是炎症的关键因子，可通过抑制VEC 一氧化氮合酶(NOS)活性进而减弱NO血管的舒张作用，加速ASO发生和进程，在ASO的形成机制中也起着关键作用〔7〕。NF-κB的活化是ASO发生的始动机制之一，通过调控炎症细胞因子(TNF-α、IL-1、IL-6等)、炎性酶〔诱导型NOS(iNOS)、环氧化酶(COX)-2〕、黏附分子〔细胞间黏附分子(ICAM)-1、VCAM-1〕、人单核细胞趋化蛋白(MCP)-1等基因表达，在ASO的进程中有着关键性作用。炎症因子不但能导致血管内皮损伤，使NF-κB活化，而且随着NF-κB的活化，释放更多的炎症因子，对炎症反应级联放大，进而促使ASO形成〔8〕。随着炎症的不断进展，激活白细胞和内皮细胞，使之释放纤维生长因子等生长因子，促进平滑肌细胞变为合成表型，促使其增殖并进入血管内膜，促使动脉粥样硬化形成。

ASO属祖国传统医学“脱疽”范畴。初起肢冷麻木，后期趾节坏死脱落，黑腐溃烂，疮口经久不愈为主要表现。根据中医“营卫气血”、“久病入络”、“久病多瘀”、“久病多虚”等理论，脱疽患者年老体衰，素体气阴不足，气虚无力推动，气血津液不能输布，津凝为痰，血滞为瘀，痰瘀互结为癥，日久最终导致痰瘀阻络，经脉不通而发病。可见，脱疽是气阴两虚为本，经络癥积瘀结为标，其病位在血脉，为本虚标实之证。因此治疗需以益气养阴、消癥散结、通经活络为主，基于此法自拟芪黄疽愈方，应用于ASO患者的治疗。经过大量的临床观察，芪黄疽愈方使ASO患者循环评分、跛行指数及踝肱比明显改善，近期疗效与西药组无明显差异，但远期疗效明显高于西药组。通过动物实验，初步证实，芪黄疽愈方具有调节脂质代谢，降低血液黏稠度的作用〔1～3〕。

本研究表明芪黄疽愈方可通过抑制炎症反应，保护血管内皮，干预ASO发展的进程。