神经生长因子对肝星状细胞生物行为学的影响

吴雄健 朱海燕 毛忠懿 张蕾

(赣南医学院第一附属医院 1消化内科，江西 赣州 341000；2体检科)

肝星状细胞(HSCs)又名肝贮脂细胞、Ito细胞、窦周细胞等，位于肝细胞与肝窦内皮细胞之间的Disse腔中，占肝细胞总数的5%～8%，是正常及肝纤维化细胞外基质的主要合成细胞，在肝脏再生、脂质代谢及免疫调节中发挥着重要作用〔1,2〕。活化的HSCs在持续的外界损伤刺激下，转化为具有胶原分泌及收缩功能特性的肌成纤维母细胞，是肝纤维化、肝硬化发生过程的中心环节〔3〕。因此抑制HSCs的活化和增殖，并诱导其凋亡是肝纤维化治疗的重要途径。神经生长因子(NGF)是一种促进中枢和外周神经发育、分化和生长的活性蛋白质，可通过与不同的NGF受体(NGFR)特异性结合而发挥不同的生物学效应〔4〕。研究显示，NGF除了具有神经营养因子(NT)的一般功能之外，还可通过与p75NT受体(NTR)的结合介导细胞凋亡的发生〔5〕。本研究拟探究NGF对HSCs增殖、凋亡的影响及其可能的作用机制。

1 材料与方法

1.1材料与仪器 HSC-T6大鼠HSCs购自上海艾研生物科技公司，NGF、Applied Biosystems TaqMan实时荧光定量聚合酶链反应(PCR)试剂盒购自美国ThermoFisher Scientific公司。CCK-8细胞增殖检测试剂盒、逆转录试剂盒购自北京索莱宝生物科技有限公司，总RNA提取试剂盒、Annexin V-异硫氰酸荧光素(FITC)细胞凋亡检测试剂盒购自碧云天生物技术有限公司。抗p53兔多克隆抗体、抗含半胱氨酸的天冬氨酸蛋白水解酶(Caspase)-3兔多克隆抗体、抗β-Tubulin兔多克隆抗体均购自英国Abcam公司，羊抗兔免疫球蛋白(Ig)G二抗购自美国Cell Signaling Technology公司。iMark酶标仪购自美国Bio-Rad公司，CyFlow® Cube8 流式细胞仪购自德国Partec公司。

1.2细胞培养 HSC-T6复苏后，重悬于DMEM高糖完全培养基(含10%胎牛血清)中，并置于37℃、5%CO2的培养箱中进行培养。当细胞密度达到90%时，胰酶消化并传代。

1.3CCK-8法检测HSCs增殖 取对数生长期细胞胰酶消化后调整细胞密度为2×105个/ml，取0.1 ml加入96孔板中，分为对照组、NGF低、中、高剂量组，每组设置3个复孔，继续培养24 h至细胞贴壁。将不同剂量的NGF(0、100、200、300 ng/ml)分别加入各组细胞中，继续培养24 h。每孔加入10 μl CCK-8，孵育4 h后，在450 nm处测定各孔吸光度(OD值)。细胞活力(%)=〔(对照组OD值-实验组OD值)/(对照组OD值-实验组OD值)〕×100%。

1.4流式细胞仪检测HSCs凋亡 分别收集0、100、200、300 ng/ml NGF孵育24 h后的细胞1×106个/ml，磷酸盐缓冲液(PBS)重悬，1 000 r/min离心5 min，弃上清，加入195 μl Annexin V-FITC结合液轻轻重悬细胞。加入5 μl Annexin V-FITC，轻轻混匀。加入10 μl碘化丙啶(PI)染色液，轻轻混匀。室温避光孵育20 min，上流式细胞仪进行检测。

1.5RT-PCR检测α-平滑肌肌动蛋白(SMA)、Ⅰ型胶原、基质金属蛋白酶组织抑制因子(TIMP)-1的mRNA表达水平 收集0、100、200、300 ng/ml NGF孵育24 h后的细胞，采用细胞总RNA提取试剂盒提取各组细胞总RNA，琼脂糖凝胶电泳检测RNA纯度。采用逆转录试剂盒将RNA逆转录为cDNA。从NCBI数据库中分别查询α-SMA、Ⅰ型胶原、TIMP-1的核苷酸序列，设计RT-PCR反应引物：α-SMA-上游引物:5′-GAAGAGGAAGACAGCACAGC-3′，下游引物:5′-CACGATGGATGGGAAAACAG-3′；Ⅰ型胶原上游引物:5′-CTGGAAACAGACCAACAACC-3′，下游引物:5′-GGTCACGTTCAGTTGGTC-3′；TIMP-1-上游引物:5′-CAGATATCCGGTCGCCTAC-3′，下游引物:5′-GGGAAACACTGTGCACACC-3′；以β-Tubulin为内参：β-Tubulin-上游引物:5′-GGAAAGCTGCGACTGTCTCC-3′，下游引物:5′-CATCAGTGTTCTCCACCAGC-3′。以cDNA为RT-PCR的模板，配置反应体系，设置RT-PCR反应程序：95℃预变性5 min；95℃变性、58℃退火、72℃延伸各30 s，40个循环；72℃延伸5 min。采用ABI 7500 RT-PCR软件进行数据分析。

1.6Western印迹检测Caspase-3、p53的蛋白表达 收集0、100、200、300 ng/ml NGF孵育24 h后的细胞2×106个，加入200 μl 含苯甲基磺酰氟(PMSF)的放射免疫沉淀法(RIPA)裂解液充分裂解细胞，14 000 r/min离心10 min，收集上清，加入50 μl 5×十二烷基硫酸钠(SDS)上样缓冲液，沸水浴中煮10 min，上样，SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳(PAGE)，转膜。5%脱脂牛奶室温孵育1 h，分别加入1∶1 000稀释的抗p53兔多克隆抗体、1∶500稀释的抗Caspase-3兔多克隆抗体和1∶500稀释的抗β-Tubulin兔多克隆抗体，4℃孵育过夜。含吐温-20的磷酸盐缓冲液(PBST)洗涤3次，每次8 min，然后分别加入1∶2 000稀释的辣根过氧化物酶(HRP)标记羊抗兔IgG二抗，室温孵育2 h，PBST洗涤3次，每次8 min，电化学发光显色液显色。

1.7统计学方法 采用SPSS20.0软件进行方差分析、t检验、χ2检验。

2 结 果

2.1NGF对HSC-T6细胞增殖的影响 不同浓度的NGF作用HSC-T6细胞后，与对照组〔(96.01±7.47)%〕比较，NGF低、中、高剂量组的细胞生长速度明显减缓，细胞活力均受到显著的抑制〔(65.10±6.11)%、(50.73±6.02)%、(42.29±4.45)%，P<0.05〕。此外，随着NGF剂量的增加，细胞活力也逐渐下降，差异有统计学意义(P<0.05)。

2.2NGF对HSC-T6细胞凋亡的影响 NGF低剂量组〔(26.61±3.40)%〕、NGF中剂量组〔(35.96±4.63)%〕、NGF高剂量组〔(43.08±4.32)%〕细胞凋亡率均显著高于对照组〔(7.17±0.82)%〕，且随着NGF剂量的增加，细胞凋亡率呈明显的剂量依赖效应，差异有统计学意义(P<0.05)，见图1。

2.3NGF对HSC-T6细胞中α-SMA、Ⅰ型胶原、TIMP-1表达的影响 与对照组相比，NGF低、中、高剂量组细胞中α-SMA、Ⅰ型胶原及TIMP-1的mRNA相对表达水平均显著下调，且随着NGF作用浓度的增加，这种变化趋势愈加明显，差异有统计学意义(P<0.05)。见表1。

2.4NGF处理后HSC-T6细胞中Caspase-3、p53表达变化 对照组、NGF低、中、高剂量组细胞中Caspase-3蛋白的相对表达水平分别为0.31±0.03、0.67±0.04、1.05±0.07、1.85±0.13；p53蛋白的相对表达水平分别为0.28±0.03、0.57±0.05、0.98±0.08、1.57±0.12。与对照组相比，NGF低、中、高剂量组细胞中Caspase-3、p53的蛋白表达水平均明显增强，并且随着NGF剂量的增加，Caspase-3、p53蛋白水平增加更显著，见图2。

图1 各组HSC-T6细胞的凋亡流式图

表1 各组细胞α-SMA、Ⅰ型胶原、TIMP-1 mRNA相对表达水平

与对照组相比：1)P<0.05；与NGF低剂量组相比：2)P<0.05；与NGF中剂量组相比：3)P<0.05

1～4：对照组，NGF低、中、高剂量组图2 各组HSC-T6细胞凋亡相关蛋白表达

3 讨 论

肝纤维化是肝脏对各种致病因素刺激造成的慢性损伤的一种损伤修复反应，主要病理表现为胶原等细胞外基质(ECM)的过度增生及过度沉积。肝纤维化是一个可逆的病理过程，致病因素的祛除可减轻肝纤维化程度甚至逆转至正常，但在致病因素的长期作用下肝纤维化晚期也可发展为肝硬化甚至肝癌〔6〕。因此，深入阐明肝纤维化的发病机制对其临床诊断和治疗具有重要的价值。

正常肝脏中静息状态的HSCs具有储存维生素A和脂肪，合成并分泌胶原、糖蛋白及蛋白多糖等基质，合成基质金属蛋白酶及其抑制剂，表达细胞因子及受体等众多生物学功能〔7〕。当肝脏受到各种致病因素的持续刺激时，活化的肝细胞、Kuffer细胞等释放多种细胞因子通过多种途径激活HSCs〔8〕。活化的HSCs在自分泌和旁分泌的共同作用下大量增殖，形态趋向于肌纤维母细胞，并伴随诸多生物学功能的改变，包括维生素A、脂滴的减少或消失，Ⅰ、Ⅲ型胶原等ECM的增加，α-SMA、波形蛋白的表达增多，TIMP-1和TIMP-2分泌的增加，收缩性和趋化性的产生等，共同参与肝纤维化的发生与发展〔9,10〕。

NGF是神经生长因子家族中的一员，可通过与两种不同的细胞表面受体(高亲和力受体-TrkA和低亲和力受体p75NTR)结合而发挥不同的生物学效应。NGF和TrkA结合可促进细胞神经细胞的存活和生长，研究显示神经损伤后NGF的表达显著上调〔11〕。当p75NTR和TrkA同时存在时，p75NTR可加强TrkA对NGF的应答，并且这种效应程度取决于p75NTR和TrkA的比例〔11〕。当p75NTR单独存在时，p75NTR和NGF的结合可诱导细胞凋亡的产生〔12〕。研究显示，NGF作为一种重要的组织修复因子，在多种神经系统及非神经系统肿瘤中发挥关键作用，广泛参与肿瘤细胞的增殖、分化和转移等过程〔13,14〕。Passino等〔15〕研究证明受损肝脏中肝细胞可表达大量的NGF；正常大鼠HSCs中p75NTR不表达，而在活化的HSCs中p75NTR高表达，表明p75NTR介导的信号通路在NGF促凋亡机制中起着重要作用〔16〕。

本研究表明TIMP-1表达的下降缓解了对基质金属蛋白酶的抑制，从而加快了ECM的降解，进而改善肝纤维化的进程。Asai等〔17〕研究显示，肝切除术后再生HSCs中产生的NGF可通过上调p75NTR和SMA的表达诱导活化HSCs的凋亡。

HSCs凋亡涉及Caspase12/Caspase3、死亡受体(Fas)CD95/Fas配体(FasL)、B细胞淋巴瘤(Bcl)-2/Bcl-2相关X蛋白(Bax)及PPAR等多条信号通路，来源于不同上游通路的激活信号可促进p53和Caspase3的活化并作用于相应的底物，从而促进细胞凋亡的发生〔18,19〕。本研究提示相关凋亡信号通路被明显激活，NGF可能通过调控Caspase-3、p53的表达诱导HSC-T6的凋亡。Oakley等〔20〕研究也表明NGF可通过降低NF-κB的活性，上调Caspase-3的表达并诱导HSCs的凋亡。

综上，NGF可能通过调控TIMP-1、Ⅰ型胶原、Caspase-3和p53等基因的表达抑制HSCs的增殖并促进其凋亡，从而发挥其抗肝纤维化的作用。但其促凋亡效应的相关上游调控机制仍需探索。